HPLC法测定天山花楸叶提取物黄酮苷的含量

GuangzhouChemicalIndustryVol．40No．15August．2012

HPLC法测定天山花楸叶提取物黄酮苷的含量

11

郑永刚，郁长治，王

2

欢，唐

辉

1

（1新疆特种植物药资源省部共建教育部重点实验室，石河子大学药学院，新疆

2新疆武警边防总队医院，新疆乌鲁木齐830000）摘

石河子832002；

要：为了建立天山花楸叶中总黄酮苷含量的测定方法，对样品酸水解处理再进行HPLC分析，色谱柱为Waters－C18

（150mm×4．6mm，5μm），柱温25℃，使用可变波长检测器；流动相为甲醇－乙腈－0．4%磷酸水溶液，梯度洗脱程序为0min（12∶

20∶68）－10min（52∶0∶48）－18min（72∶0∶28）；流速1．0mL/min，检测波长为360nm。结果表明：槲皮素浓度在5．98～47．84μg/mL之

r=0．9995。平均回收率94．86%，RSD=1．9%；山柰素浓度在回归方程A=66．96C－5．9964，间与色谱峰面积呈良好的线性关系，

4．04～28．28μg/mL之间与色谱峰面积呈良好的线性关系，r=0．9999，RSD=回归方程A=50．114C－19．529，平均回收率93．89%，2．7%；其黄酮苷百分含量为（12．62±0．40）%。该方法干扰少，灵敏，简便，重现性好，可为天山花楸叶的药用开发利用提供质量控制方法。

关键字：天山花楸；黄酮苷；槲皮素；山柰素；HPLC中图分类号：R284．1

文献标识码：A

文章编号：1001－9677（2012）15－0161－03

DeterminationoftheContentofFlavonoidGlycosidesExtractedfrom

SorbustianschanicaLeavesbyHPLC

ZHENGYong－gang1，YUChang－zhi1，WANGHuan2，TANGHui1

（1CollegeofPharmacy，ShiheziUniversity，KeyLaboratoryofXinjiangPhytomedicineResources，XinjiangShihezi832002；2ArmedPoliceandFrontierCorpsHospitalofXinjiangAutonomousRegion，XinjiangUrumqi830000，China）Abstract：AnmethodfordeterminationofthecontentofflavonoidglycosidesextractedfromSorbustianschnicawasestablished．Thesamples，whichwerehydrolyzedwithacid，wereanalyzedbyRP－HPLC．Theanalysiswascarriedout

5μm）column，ThemobilephasewascomposedofA（methanol）－phaseB（ace-onawaters－C18（4．6mm×150mm，

tonitrile）－phaseC（0．4%phosphoricacidwatersolution）ingradientelution0min（12∶20∶68）－10min（52∶0∶48）－18min（72∶0∶28）byflowrateof1．0mL/mininthismethod，thedetectionwavelengthwassetat360nm，theVWDwasusedandthecolumntemperaturewas25℃．Thelinearrelationshipofquercetinwasgood5．98～47．84μg/mL，A=66．96C－5．9964，andr=0．9995．Theaveragerecoverywas94．86%，（RSD=1．9%），thelinearrelationshipofkaempferolwasgood4．04～28．28μg/mL，A=50．114C－19．529，andr=0．9999．Theaveragerecoverywas93．89%，（RSD=2．7%）．Thecontentofflavonoidglycosideswas（12．62±0．40）%．Thismethodwassimple，sensitiveandlessinterference，reproducible，theutilizationofqualitycontrolmethodwiththeleafofSorbustianschanica．

Keywords：Sorbustianschanica；flavonoids；quercetin；kaempferol；HPLC

天山花楸（SorbustianshanicaRupr．）为蔷薇科（Rosaceae）花楸属植物（Sorbus），系新疆维吾尔族和哈萨克族民间用药，常用于治疗哮喘，咳嗽等病症用

［2－8］［4－6］

［1］

1仪器与材料

。实验研究表明天山花楸叶、果具有

依赖性地抑制心肌收缩和保护心肌缺血等作平喘镇咳祛痰，

。实验发现天山花楸中有效成分主要为黄酮类化合。因此，用RP－HPLC法对天山花楸叶黄酮提取物中总

物

为天山花楸叶的原料药及制剂研究提黄酮苷含量进行了测定，

供有效的质量控制标准及控制方法。

美国AgilentHP1100型高效液相色谱系统（配有：四元泵，紫

ChemStations色谱工作站）；德国Sartorius外可变波长检测器，

BP211D十万分之一电子分析天平；上海科导SK5200HP超声清洗器。

槲皮素，山柰素对照品（中国药品生物制品检定所，批号分

110861－200808）；甲醇，别为100081－200406，乙腈为色谱纯

（FisherScientific），水为双蒸水；磷酸、甲醇（样品溶剂）、盐酸及其它试剂均为分析纯。

作者简介：郑永刚（1985－），男，汉族现为石河子大学药学院在读硕士研究生，主要从事天然药物分析及制剂研究。通讯作者：唐辉（1967－），女，汉族现任石河子大学药学院教授，博士学位，硕士生导师，主要从事药物分析及新药研究。

162广州化工2012年8月

天山花楸叶黄酮提取物（比色法测定其总黄酮含量61．2%）：天山花楸叶阴干粉碎成末，提取温度为60℃，料液比

乙醇浓度为60%，其中超声功率60Hz，时间30min，为1/10g/mL，

连续提取2次，过滤、回收滤液、旋转蒸发浓缩，再经AB－8大孔

［9］

真空冷冻干燥而得。吸附树脂除杂纯化、

在此色谱条件下，精密吸取对照品溶液、样品溶液进样，结

17．33min；分离度均山柰素的保留时间分别为14．04，果槲皮素、

大于1．5；理论塔板数按槲皮素峰计算值算应不低于41000；结果

结果见图1。样品中各组分的色谱峰分离度良好，

2

2．1

溶液制备

对照品溶液

4

4．1

方法学考察

线性关系的考察

分别精密称取槲皮素14．95mg和山柰素10．10mg，甲醇溶

摇匀定容到50mL容量瓶，稀释5倍制得浓度为59．80μg/mL和解、

40．40μg/mL的对照品溶液，备用。

2．2样品溶液

精密量取2．1项下的两种对照品溶液1mL，2mL，3mL，

4mL，5mL，6mL，7mL，8mL至10mL的容量瓶中，用甲醇稀

以浓度C（μg/mL）对色谱峰面积释定容。分别以20μL量进样，

A进行线性回归，可得标准曲线，其回归方程、相关系数及线性范围如表2。

表2线性关系

Table2linearrelationship

对照品槲皮素山柰素

回归方程A=66．96C－5．9964A=50．114C－19．529

相关系数（r）0．99950．9999

线性范围/（μg/mL）

5．98～47．844．04～28．28

称取天山花楸叶黄酮提取物约75mg，加甲醇30mL，25%（V/V）HCl5mL，使其溶解于50mL磨口锥形瓶中，沸水浴回流

冷却，转移至50mL容量瓶中，用甲醇稀释定容；再水解60min，

用甲醇稀释定容，用精密量取其5mL移至10mL的容量瓶中，

0．45μm微孔滤膜过滤作为样液，即得。

3HPLC色谱条件

WatersC18柱（150mm×4．6mm，5μm）；检测波长360nm；温

4．2精密度试验

度25℃；流动相为甲醇－乙腈－0．4%磷酸溶液组成，采用梯度洗脱，运行时间25．00min；平衡时间10．00min；进样量20μL，流速为1．0mL/min。其梯度洗脱条件见表1。

表1HPLC梯度条件

Table1gradientprogramofHPLC

运行时间/min

0．0010．0018．00

甲醇/%125272

乙腈/%2000

0．4%磷酸水/%

684828

取同一对照品溶液（槲皮素，山柰素的浓度分别为11．96，4．04μg/mL），在上述色谱条件下连续进样6次，计算槲皮素，山

1．2%。柰素的峰面积的RSD分别为1．1%，

4．3重复性试验

精密称取同批号天山花楸叶黄酮提取物样品75mg，共6

“2．2”份，按照项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分

别进样测定。结果样品中总黄酮的平均含量（n=6）为12．65%；RSD为1．9%。

4．4稳定性试验

2，4，6，8，10h进样测定，取同一供试品溶液分别在0，结果

天山花楸叶黄酮提取物中总黄酮的含量RSD（n=6）为0．27%。表明供试品溶液中的黄酮在10h内稳定。

4．5回收率试验

精密称取天山花秋叶黄酮提取物38mg，分别加入6mL

5mL浓度为0．2004mg/mL浓度为0．2002mg/mL的槲皮素，

的山柰素对照品标准溶液，按样品处理方法，分别测定槲皮素，山柰素的加样回收率，每次进样20μL，结果槲皮素，山柰素的

93．89%；RSD分别为平均回收率（n=6）分别为94．86%，

1．9%，2．7%。

4．6样品含量测定

Fig．1

图1对照品（A）、样品（B）HPLC图谱

HPLCchromatogramsofreferencesubstance（A），sample（B）1．槲皮素（quercetin）；2．木犀草素（luteolin）；3．山柰素（kaempferol）；4．异鼠李素（isorhamnetin）

［10］

由于天山花楸叶中有七、八种黄酮类化合物，难以一一

从药效学角度，也只要测定总黄酮含量。从定量测定单个成分，

山柰素两种苷元。水解后的HPLC图上也可看出主要为槲皮素，

2种主要故选择他们作为定量的标准。采用测量峰面积外标法，

的水解苷元分别以槲皮素，山柰素作为对照，计算样品水解后各苷元的含量；参照目前较成熟的银杏黄酮苷定量方法的相关文［11－12］

，献可用分子量为610的芦丁对槲皮素的转换因子2．02和

分子量为534的山柰素糖苷（经LC－MS－MS分析获得相应苷的相对分子量，推断其为山柰素－葡萄糖苷－丙二酸酯）对山柰素转换因子1．87通过下面的转换关系来计算天山花楸黄酮苷的含量。

第40卷第15期郑永刚等：HPLC法测定天山花楸叶提取物黄酮苷的含量163

天山花楸黄酮苷的含量=槲皮素量×2．02+山柰素量×1．87

=3．112×2．02+1．678×1．87=9．426（mg）

天山花楸黄酮苷（%）=黄酮苷量/样品量×100%

=9．426/74．71×100%=（12．62±0．40）%

而样品的酸水解液却相当稳定。而山柰素对照品溶液色变深，

稳定性很好。

5．4天山花楸黄酮苷

5

5．1

讨论

HPLC实验条件的选择

天山花楸的黄酮苷成分十分复杂，难以直接测定各种黄酮苷的含量；而这些黄酮苷经水解发现其苷元主要为黄酮醇类槲皮素和山柰素。采用水解法，得到苷元（槲皮素、山柰素）经HPLC分离检测，用外标法测得各苷元量分别乘转换因子，得出

重现性好，可在一定程度上反映天山黄酮苷含量。本法干扰少，

花楸叶黄酮提取物及制剂的质量。

参考文献

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天山花楸叶黄酮提取物水解后主峰为槲皮素、山柰素。本

实验选用甲醇－乙腈－磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱。本实验发现：采用梯度洗脱与等度洗脱相比，基线未见明显漂

但岀峰更加敏锐，峰形尖锐，改善了分离效果，使后出的峰扩移，

散程度减小。由于本法是以槲皮素和山柰素作为定量标准，故减小峰扩张更显得重要。梯度洗脱对于其他组分的峰也分离的

便于更好地了解产品的全貌，以利于生产过程的控制。较清楚，

5．2水解实验条件的选择

①水解时间，天山花楸黄酮提取物在本样品制备条件下可

水解完全，水解60min与90min所得结果无显著性差异。通过考察了同一批样品，在其他条件一致的情况下，分别测定了30min、60min和90min3个时间点的总黄酮苷的含量，分别为（10．10±0．18）%，（12．62±0．40）%和（12．86±0．27）%（n=

90min的含量间有显著性差异（P＜4）。30min与60min，

0．05）。由于30min的水解时间太短，样品水解不完全，从而导致含量偏低。②盐酸浓度，对同一批样品分别在25．0%，12．5%，6．25%盐酸液中水解，结果总黄酮苷的含量分别为（12．62±0．40）%，（9．87±0．21）%和（7．33±0．13）%（n=4）。三者间有非常显著的差异（P＜0．05）。实验结果表明25%（V/V）盐酸浓度较合适。如果降低盐酸浓度，会导致水解不完全，造成测定的含量偏低。但是盐酸浓度也不宜再增加，否则会影响色谱柱的寿命。

5．3样品稳定性

在实验中发现，槲皮素对照品溶液稳定性确实较差，日久颜