经典和高致病性PRRSV疫苗株嵌合病毒的构建及其免疫原性分析

第３７卷第４期　中国预防兽医学报　Ｖｏ１．３７．ＮＯ．４　２０１５年４月　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ａｐｒ．２０１５　ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００８－０５８９．２０１５．０４．０１　经典和高致病性ＰＲＲＳＶ疫苗株嵌合病毒的构建　及其免疫原性分析　张武超１，２，冷超粮　，张洪亮　，陈家锃　，白　云　，张秋月：，彭金美：，　刘永刚　，童光志　，田志军　，蔡雪辉　（１．吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春１３０１１８；２．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／　动物病原检测与流行病学研究创新团队，黑龙江哈尔滨１５０００１；３．中国农业科学院上海兽医研究所，上海２００２４１）　摘要：为研究经典和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＨＰ．ＰＲＲＳＶ）￣苗株间的生物学差异，本实验以经　典ＰＲＲＳＶ疫苗株ＣＨ．１Ｒ的全长感染性克隆ｐＣＨ．１Ｒ为骨架，利用反向遗传操作技术分别将其ＯＲＦｌａ、ＯＲＦｌｂ和　ＯＲＦ２—７替换为ＨＰ．ＰＲＲＳＶ　ＨｕＮ４．Ｆｌ１２的相应片段，构建３个全长ｃＤＮＡ嵌合质粒。将构建的３个重组ｃＤＮＡ质　粒经体外转录后转染ＢＨＫ．２１细胞，并于Ｍａｒｃ．１４５细胞中传代，拯救出３种嵌合病毒，分别命名为ｒＣＨ．１Ｒ．Ｔｌａ、　ｒＣＨ．１Ｒ－Ｔｌｂ和ｒＣＨ．１Ｒ．Ｔ２７。病毒一步生长曲线结果表明，３种嵌合病毒在Ｍａｒｃ．１４５细胞中的生长特性与亲本病　毒ＣＨ．１Ｒ基本一致；动物实验结果显示，嵌合病毒实验组血清中ＰＲＲＳＶ　Ｎ蛋白抗体阳转率分别为３／３（ｒＣＨ．１Ｒ－　Ｔｌａ）、２／３（ｒＣＨ．１Ｒ－Ｔｌｂ）和１／３（ｒＣＨ．１Ｒ—Ｔ２７），而ＣＨ．ＩＲ免疫组血清Ｎ蛋白抗体检测始终为阴性。以上结果表明，　ＨＰ．ＰＲＲＳＶＨｕＮ４．Ｆ１１２非结构蛋白在Ｎ蛋白抗体产生中起关键辅助或协同作用。　关键词：猪繁殖与呼吸综合征；嵌合病毒；ＯＲＦｌａ；ＯＲＦｌｂ；ＯＲＦ２．７　中图分类号：￥８５２．６５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８．０５８９（２０１５）０４—０２４１—０５　Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ａｎｄ　ｈｉｇｈｌｙ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ＺＨＡＮＧ、＾　一ｃｈａｏ　－－，ＬＥＮＧ　Ｃｈａｏ—ｌｉａｎｇ￣，ＺＨＡＮＧ　Ｈｏｎｇ—ｌｉａｎｇ：，ＣＨＥＮ　Ｊｉａ－ｚｅｎｇ２，ＢＡＩ　Ｙｕｎ　，　ＺＨＡＮＧ　Ｑｉｕ—ｙｕｅ　，ＰＥＮＧ　Ｊｉｎ．ｍｅｉ　，ＬＩＵ　Ｙｏｎｇ－ｇａｎｇ２，ＴｏＮＧ　Ｇｕａｎｇ—Ｚｈｉ　，ＴＩＡＮ　Ｚｈｉ－ｊｕｎ　，ＣＡＩ　Ｘｕｅ－ｈｕｉ　’　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉｌｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｎｎ　１３０１１８，Ｃｈｉｎａ；２．Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｔｅａｍ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｓｕｒｖｅｉｌｌｎａｃｅ　ａｎｄ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｂｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ　１５０００１，Ｃｈｉｎａ；　３．Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｕｔｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｕｔｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ａＲｅｎｕａｔｅｄ　ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ（ＰＲＲＳＶ）ａｎｄ　ｈｉｇｈｌｙ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ＰＲＲＳＶ（ＨＰ。ＰＲＲＳＶ）ｖａｃｃｉｎｅ　ｓｔｒａｉｎｓ，ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｃｌｏｎｅ　ｏｆ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ＰＲＲＳＶ　ｏｆ　ｐＣＨ．１Ｒ。ｔｈｒｅｅ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｆｕｌ１．１ｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｔｈｅ　ＯＲＦｌａ，ＯＲＦｌｂ　ａｎｄ　ＯＲＦ２—７　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ｐＣＨ．１Ｒ　ｗｅｒｅ　ｒｅｐｌａｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ＨＰ—ＰＲＲＳＶ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｓｔｒａｉｎ　ＨｕＮ４一Ｆ１　１２，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｆｕｌｌ＿ｌｅｎｇｔｈ　ＲＮＡｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｔｒｈｅｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅｓ　ｂｙ抽ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ＢＨＫ一２　１　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｖｉｒｕｓ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｐａｓｓａｇｅｄ　ｉｎ　Ｍａｒｃ一１４５　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｒｅｓｃｕｅ　ｔｈｅ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｖｉｒｕｓ，ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｌｙ，ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ　ｒＣＨ一１Ｒ－Ｔｌａ，　＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ　收稿日期：２０１４．０９．２３　基金项目：国家自然科学基金（３１００１０５０、３１２７００４５）；黑龙江省杰出青年科学基金（ＪＣ２０１３１４）　作者简介：张武超（１９９１一），男，河南汝州人，硕士研究生，主要从事猪繁殖与呼吸综合征病毒分子免疫学研究　通信作者：Ｅ．ｍａｉｌ：ａｃｉ１３９＠ｓｎｉａ．ｃｏｍ；ｔｚｊ＠ｈｖｒｉ．ａｃ．ｃｎ　２４２　中国预防兽医学报　２０１５拄　ｒＣＨ一１Ｒ—Ｔｌｂ　ａｎｄ　ｒＣＨ．１Ｒ．Ｔ２７．Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｒｅｖｅ￣ｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｒｅｅ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｔｏ　ｔｈｅｉｒ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｖｉｒｕｓ　ＣＨ．１Ｒ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅ　ａｎｉｍａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｔｅｄ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｈｅ　ａｎｔｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ＰＲＲＳＶ　Ｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｐｉｇｌｅｔｓ　ｗｅｒｅ　３／３　ｆｏｒ　ｒＣＨ一１Ｒ—Ｔｌａ．２／３　ｆ０ｒ　ｒＣＨ一１Ｒ－Ｔｌｂ　ａｎｄ　１／３　ｆｏｒ　ｒＣＨ一１Ｒ－Ｔ２７，ｂｕｔ　ｎｏ　ａｎｔｉ－Ｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＣＨ－１Ｒ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｐｉｇｌｅｔｓ．Ｏｕｒ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｎｏｎｓｔｍｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＨｕＮ４－Ｆ１　１２　ｐｌａｙｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｏｆＮ　ｐｒｏｔｅｉｎ抽ｖｉｖｏ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｖｉｒｕｓ；ＯＲＦｌａ；ＯＲＦｌｂ；ＯＲＦ２—７　猪繁殖与呼吸综合征（Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ）是一种由ＰＲＲＳ病毒　（ＰＲＲＳＶ）引起的猪病毒性传染病，主要临床特征为　妊娠母猪繁殖障碍和各年龄阶段猪呼吸系统疾病［１］。　国内于１９９６年从发病猪场首次分离到ＰＲＲＳＶ［２１，　２００６年由ＰＲＲＳＶ变异株引起的高致病性ＰＲＲＳ　ｆＨＰ．ＰＲＲＳ）给我国养猪业造成了严重的经济损失，　已成为严重危害我国养猪业的传染病之一［３－５］。目　前，疫苗免疫仍是防控ＰＲＲＳ的有效方法，但现有　的经典ＰＲＲＳＶ和ＨＰ．ＰＲＲＳＶ疫苗在诱导机体免疫　反应和交叉保护等方面存在很大差异　】，而关于这　种差异产生的机制尚无报道。　本实验以经典ＰＲＲＳＶ疫苗株ＣＨ．１Ｒ的全长感　染性克隆ｐＣＨ．１Ｒ为骨架，将其ＯＲＦｌａ、ＯＲＦｌｂ和　ＯＲＦ２．７分别替换为Ｈ．ＰＲＲＳＶ　ＨｕＮ４．Ｆ１１２的相应片　段，拯救出３种嵌合病毒，免疫原性比较结果表　明，ＨｕＮ４一Ｆ１１２非结构蛋白在ＰＲＲＳＶ　Ｎ蛋白抗体　产生中起关键辅助或协同作用。本研究在分子水平　揭示了经典ＰＲＲＳＶ与ＨＰ．ＰＲＲＳＶ疫苗株间的免疫　学差异，同时为ＰＲＲＳ新型基因工程疫苗的研发奠　定基础。　１　材料和方法　１．１　主要实验材料及实验动物经典ＰＲＲＳＶ和　ＨＰ－ＰＲＲＳＶ疫苗株的全长ｃＤＮＡ感染性克隆ｐＣＨ．１Ｒ　和ｐＨｕＮ４．Ｆ１１２由本实验室构建　；重组亲本病毒　ＣＨ－１Ｒ（ｒＣＨ．１Ｒ）由本实验室拯救并保存；ＢＨＫ．２１、　Ｍａｒｃ一１４５传代细胞系和抗ＰＲＲＳＶ　Ｎ蛋白的单克隆　抗体（ＭＡｂ）由本实验室制备；１５头４周龄ＰＲＲＳＶ抗　原抗体阴性健康仔猪购自哈尔滨市周边某猪场。　１．２主要试剂　限制性内切酶和Ｔ４　ＤＮＡ连接酶购　自ＮＥＢ公司；ＲＮｅａｓｙＰｌｕｓＭｉｎｉＲＮＡＫｉｔ购自Ｑｉａｇｅｎ　公司；转染试剂ＤＭＲＩＥ．Ｃ购自Ｉｎｖｉｒｔｏｒｇｅｎ公司；体　外转录试剂盒ｍＭｅｓｓａｇｅ　Ｈｉｇｈ　Ｙｉｅｌｄ　Ｃａｐｐｅｄ　ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｋｉｔ购自Ａｍｂｉｏｎ公司；山羊抗小鼠　ＦＩＴＣ荧光标记的ＩｇＧ（ＦＩＴＣ．ＩｇＧ）购自北京中杉金桥　生物技术有限公司；感受态细胞ＤＨ５ａ、Ｔｒａｎｓｌ１０　和ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ购自北京全式金生物技术有限公司；　ＩＤＥＸＸ　ＰＲＲＳＶ　Ｘ３　Ｋｉｔ购自中国ＩＤＥＸＸ公司。　１．３嵌合病毒的构建策略分别选择限制性内切　酶Ｐａｃ　Ｉ／Ａｓｃ　Ｉ作为替换ＯＲＦｌａ基因、Ｎｈｅ　Ｉ／Ａｓｃ　Ｉ作　为替换ＯＲＦｌｂ基因及Ａｓｃ　Ｉ／Ｓｗａ　Ｉ作为替换ＯＲＦ２．７　基因所用的酶切位点进行嵌合病毒的构建（图１）。　ｐｃＨ＿　Ｒ　ｌＰａｃ　Ｉ　ＮｎｅＩ　Ａ５ｃＩ　ｌ　ＳｗＩ　ｉ　５ｑＪＴＲ　ｐＨｕＮ４－Ｆ１　１２　５’ＵｒＲ—　ｐＣＨ－１Ｒ－Ｔｌｂ　５。ＵＴＲ—　ｐＣＨ－１Ｒ－Ｔ２７　５－ｕｎＲＪ　图１　ＰＲＲＳＶ嵌合病霉构建示意图　Ｆｉｇ．１　Ｃｏｎｌｉｌｒｕ￣ｌｏｎ　ｓｄｌｃｌｎｌ￣ｅ　Ｏｆ￣，ｈｉｌｎｌ￣ｃＰＲＲＳＶｓ　１．４嵌合病毒基因组的体外转录　利用３’端Ｐｏｌｖ　（Ａ）尾引入的Ｓｗａ　Ｉ限制性酶切位点将３种重组质粒　线性化。根据体外转录试剂盒说明书合成病毒　ＲＮＡ，转录反应体系为：１０　Ｌ　２ｘＮＴＰ／ＣＡＰ，２　Ｌ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ，２　ＩｘＬ　１０ｘＲｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ，１　ｇ线性化　质粒模板，加无核酸酶水至２０　，置于３７℃水浴　锅中转录１　ｈ～２　ｈ。　１．５嵌合病毒的拯救按照转染试剂ＤＭＲＩＥ　Ｃ试　剂操作说明方法，将体外转录合成的嵌合病毒ＲＮＡ　转染于细胞密度为７０％～９０％的ＢＨＫ．２１细胞。并　于３７℃５％ＣＯ　中培养４　ｈ，弃上清液，加入２％　～３％ＦＢＳ的细胞维持液。培养２４　ｈ后收取转染细　胞，反复冻融、离心，取上清液接入培养４８　ｈ的单　层Ｍａｒｃ．１４５细胞按常规方法进行培养，观察细胞病　变（ＣＰＥ），并进行连续传代培养。　第４期　张武超，等．经典和高致病性ＰＲＲＳＶ疫苗株嵌合病毒的构建及其免疫原性分析　２４５　成，其生物学和免疫学特性等均有可能发生改变。　本实验室前期研究表明，经典ＰＲＲＳＶ　ＣＨ．１Ｒ疫苗　一次免疫后，血清中Ｎ蛋白的抗体水平较低［１４】，而　ＨＰ．ＰＲＲＳＶ　ＨｕＮ４．Ｆ１１２疫苗免疫后，第２周血清Ｎ　蛋白抗体就全部转阳，并且Ｓ／Ｐ值维持在３左右。　本实验中，嵌合病毒ｒＣＨ．１Ｒ－Ｔｌａ和ｒＣＨ．１Ｒ－Ｔｌｂ免　疫动物后，可诱导机体产生Ｎ蛋白抗体且水平较　高，从而证明，ＨＰ．ＰＲＲＳＶ　ＨｕＮ４．Ｆ１１２非结构蛋白　在Ｎ蛋白抗体产生中起关键的辅助或协同作用。虽　然国内外对ＰＲＲＳＶ非结构和结构蛋白的功能研究　已取得了相应的进展，但这些蛋白功能的确切机制　仍知之甚少。因此，关于ＰＲＲＳＶ诱导机体免疫应　答的具体机制，还需要进行深入的研究。　参考文献　Ｌｕｎｎｅｙ　Ｊ　Ｋ，Ｂｅｎｆｉｅｌｄ　Ｄ　Ａ，Ｒｏｗｌａｎｄ　Ｒ　Ｒ．Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ：ａｎ　ｕｐｄａｔｅ　ｏｎ　ａｎ　ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ａｎｄ　ｒｅ－ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｖｉｒａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｏｆ　ｓｗｉｎｅ［Ｊ】．Ｖｉｕｒｓ　Ｒｅｓ，２０１０，１５４　（１－２）：１－６．　［２］　郭宝清，陈章水，刘文兴，等．从疑似ＰＲＲＳＶ感染的胎儿　分离ＰＲＲＳＶ的研究［Ｊ］．中国预防兽医学报，１９９６，１８（２）：　１—４．　【３］　童光志，周艳君，郝晓芳，等．高致病性猪繁殖与呼吸综　合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析［Ｊ］＿中国预防　兽医学报，２００７，２９（５）：３２３—３２６．　【４】　Ｔｏｎｇ　Ｇｕａｎｇ—ｚｈｉ，Ｚｈｏｕ　Ｙａｎ＿ｊｌⅡ１，Ｈａｏ　Ｘｉａｏ—ｆｅｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ｈｉｇｈｌｙ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｎｙｄｒｏｍｅ，Ｃｈｉｎａ　【Ｊ］．Ｅｍｅｒｇ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，２００７，１３（９）：１４３４—１４３６．　［５】　Ａｎ　Ｔｏｎｇ・ｑｉｎｇ，Ｔｉａｎ　Ｚｈｉ－ｊｕｎ，Ｘｉａｏ　Ｙａｎ，ｅｔ　ａ１．Ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｈｉ曲ｌｙ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ，　Ｃｈｉｎａ［Ｊ】．Ｅｍｅｒｇ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，２０１０，１６（２）：３６５—３６７．　［６］　Ｔｉｎａ　Ｚｈｉ－ｊｕｎ，Ａｎ　Ｔｏｎｇ—ｑｉｎｇ，Ｚｈｏｕ　Ｙａｎ＿ｊＬｕ１，ｅｔ　ａ１．Ａｎ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｌｉｖｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｈｉｇｈｌｙ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ（ｕＰ－ＰＲＲＳＶ）ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ｐｉｇｌｅｔｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ＨＰ—ＰＲＲＳ［Ｊ］．Ｖｅｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００９，１３８（１—２）：３４—４０．　［７】　孟甄祥，安同庆，陈家锃，等．高致病性ＰＲＲＳ活疫苗　（ＨｕＮ４一Ｆ１１２株）抗体对ＩＩ型不同亚群ＰＲＲＳＶ的中和效果［Ｊ］＿　中国预防兽医学报，２０１２，３４（５）：４０１．４０４．　［８］　Ｚｈａｎｇ　Ｓｈａｎ・ｒｕｉ，Ｚｈｏｕ　Ｙａｎ－ｊｕｎ，Ｊｉｎａｇ　Ｙｉ—ｆｅｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｌ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｃｌｏｎｅ　ｏｆ　ＨｕＮ４－Ｆ１　１２，ａｎ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｌｉｖｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ【Ｊ］．　Ｖｉｒｏｌ　Ｊ，２０１１，８：４１０—４１６．　［９］　Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ　Ｊ　Ｊ，Ｂｏｓ—ｄｅ　Ｒｕｉｊｔｅｒ　Ｊ　Ｎ，Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ａｎ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｅＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ａｄｖ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　Ｂｉｏｌ，１９９８，４４０：１９９—２０６．　［１０］　Ｎｉｅｌｓｅｎ　Ｈ　Ｓ，Ｌｉｕ　Ｇ，Ｎｉｅｌｓｅｎ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎａ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｃｌｏｎｅ　ｏｆ　ＶＲ－２３３２，ａ　ｈｉｇｈｌｙ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ－ｔｙｐｅ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｕｒｓ【Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，２００３，７７（６）：３７０２—３７１　１．　Ｗａｎｇ　Ｙｕｅ，Ｌｉａｎｇ　Ｙａ－ｊｉｅ，Ｈａｎ　Ｊｕｎ，ｅｔ　ａ１．Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＲＲＳＶ　ｓｔｒａｉｎ　ＭＮ１　８４　ｕｓｉｎｇ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｗｉｎｌ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００８，３７１（２）：４１８—４２９．　［１２］　Ｋｗｏｎ　Ｂ，Ａｎｓａｒｉ　Ｉ　Ｈ，Ｐａｔｔｎａｉｋ　Ａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｍ—　ｌｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎ—　ｒｄｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｃｌｏｎｅｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏ—　ｇＹ，２００８，３８０（２）：３７１—３７８．　［１３］　Ｌｉ　Ｙａｎ，Ｚｈｏｕ　Ｌｅｉ，Ｚｈａｎｇ　Ｊｉａ－ｌｏｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ｎｓｐ９　ａｎｄ　Ｎｓｐｌ０　ｃｏｎ—　ｔｉｒｂｕｔｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｆａｔａｌ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｉｇｈｌｙ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏ—　ｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｎｙｄｒｏｍｅ　ｖｉｕｒｓ　ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ【Ｊ］．　ＰＬｏＳ　Ｐａｔｈｏｇ，２０１４，１０（７）：ｅ１００４２１６．　［１４］　冷超粮．高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗诱导中和抗体　产生的分子基础【Ｄ】．广州：华南农业大学，２０１４．　（本文编辑：赵晓岩）