(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110038116 A(43)申请公布日 2019.07.23
(21)申请号 201810036634.0(22)申请日 2018.01.15
(71)申请人 武汉大学
地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山(72)发明人 宋保亮 李云峰 魏健 (74)专利代理机构 北京律诚同业知识产权代理
有限公司 11006
代理人 黄韧敏(51)Int.Cl.
A61K 38/17(2006.01)A61K 39/395(2006.01)A61K 31/7105(2006.01)A61P 3/04(2006.01)A61P 3/06(2006.01)A61P 3/10(2006.01)
(54)发明名称
人肝脏分泌蛋白GPNMB或其拮抗剂或激动剂的用途(57)摘要
本发明涉及人肝脏分泌蛋白GPNMB或其拮抗剂或激动剂的用途，本发明发现GPNMB基因和GPNMB蛋白可用作治疗肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗和高脂血症等代谢性疾病的药物靶标。
A61P 5/50(2006.01)C12Q 1/6883(2018.01)G01N 33/68(2006.01)
权利要求书1页 说明书8页序列表6页 附图3页
CN 110038116 ACN 110038116 A
权 利 要 求 书
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1.人肝脏分泌蛋白GPNMB或其拮抗剂或激动剂的用途，其中将所述GPNMB蛋白或其拮抗剂或激动剂用于诊断代谢性疾病，或将所述GPNMB蛋白或其拮抗剂或激动剂用于制备治疗和/或预防代谢性疾病的药物，所述GPNMB蛋白包括：
1)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白；或2)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有诊断、预防和治疗代谢性疾病功能的由(1)衍生的蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述代谢性疾病选自肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗和高脂血症。
3.根据权利要求1的应用，其中所述GPNMB蛋白的拮抗剂或激动剂选自：1)能与GPNMB蛋白结合的蛋白；2)能促进GPNMB蛋白降解的药物；3)能抑制GPNMB蛋白合成的药物；4)能抑制GPNMB蛋白活性的药物；和
5)能特异性下调编码GPNMB蛋白的基因表达的药物。4.根据权利要求3所述的应用，其中所述拮抗剂为中和GPNMB蛋白的抗体。5.根据权利要求3所述的应用，其中所述能特异性下调编码GPNMB蛋白的基因表达的药物为可敲低Gpnmb基因表达的腺病毒相关病毒表达载体。
6.根据权利要求3所述的应用，其中所述能特异性下调编码GPNMB蛋白的基因表达的药物为可敲低Gpnmb基因表达的RNA干扰技术或反义核苷酸。
7.编码GPNMB蛋白的基因在诊断代谢性疾病中的用途，其中所述GPNMB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述代谢性疾病选自肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗和高脂血症。
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说 明 书
人肝脏分泌蛋白GPNMB或其拮抗剂或激动剂的用途
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技术领域
[0001]本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及蛋白Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B(GPNMB)在代谢性疾病(如：肥胖、糖尿病、胰岛素抵 抗、高脂血症等)的诊断、治疗与医药研发中的应用。背景技术
[0002]近年来，肥胖及相关疾病(包括：肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗、高脂血症 等)大量增加，并逐渐变成影响公众健康及其生活质量的主要问题。根据世界 卫生组织统计，超过1亿的成年人体重超重(身体质量指数BMI>25)，其中，300 多万成年人是严重肥胖(BMI>30)。在亚洲国家，2型糖尿病患者的数量急剧上 升，而肥胖就是发展为2型糖尿病的主要危险因素。事实上，仅在过去的十年 中，中国糖尿病患者的数量几乎增加了一倍，据统计有1.26亿患者。
[0003]因为肥胖往往是由于能量摄入超过能量消耗所导致的，所以目前治疗肥胖 的方法主要为减少能量的摄入，如节食，但是该方法的长期执行比较难，治疗 效果差；药物治疗对胃肠、肾脏以及心脏具有较强的副作用。目前治疗肥胖的 最有效的方法是手术，由于价格昂贵而未能得到广泛的应用。随着我国人们饮 食结构变化及生活习惯的变化，肥胖及肥胖引起的各类代谢性疾病发生越来越 多，迫切需要加强自主知识产权的新型药靶系统与创新药的研究。
[0004]GPNMB是一个一型跨膜蛋白，基因位于人体第七号染色体，由572个氨基 酸构成。完整的跨膜蛋白可以被胞外蛋白酶如ADAM10剪切，释放出GPNMB 的胞外段入血发挥细胞因子的作用。GPNMB在正常骨、造血系统和皮肤等组织 内都能被检测到，另外也能在乳腺癌，黑色素瘤，肝细胞癌等恶性增生组织高 水平检测到。我们的专利研究首次证明GPNMB作为一个肝脏分泌蛋白在肥胖 及其相关代谢疾病中扮演十分重要的角色。发明内容
[0005]发明人在进行脂肪代谢研究中发现，L-Scap-/-和L-gp78-/缺陷型小鼠的 肝脂肪酸合成下降，但同时白色脂肪组织的脂肪酸合成上升。进行血清研究发 现，确认小鼠肝脏分泌的物质能上调脂肪合成相关基因表达。提取缺陷小鼠中 上调表达了的基因，一共301个基因，再找出12个带有N端信号肽的蛋白编 码基因，进一步定量PCR，确定了4个表达水平相对于野生型升高30倍以上 的基因，即Gpnmb、Timp1、Ly6d、Lcn2，最后构建腺病毒表达载体验证， 确认是基因Gpnmb引起了白色脂肪组织的脂肪酸合成上升。[0006]本发明的一个目的是提供Gpnmb基因在诊断、预防和治疗肥胖及其相关代 谢性疾病药物中的应用。
[0007]本发明的另一个目的是提供GPNMB蛋白在诊断、预防和治疗肥胖及其相 关代谢性疾病药物中的应用。
[0008]本发明鉴定出，鼠肝脏分泌的Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein
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B(GPNMB)能显著的增强白色脂肪的脂肪合成能力，降低小鼠能量代谢， 引起小鼠的肥胖、高脂血症和胰岛素抵抗。而在肥胖的小鼠中，血液中GPNMB 的水平相对于正常小鼠都有明显升高。对人群分析表明，血液中GPNMB水平 与体重、肥胖、血压、胰岛素抵抗、糖尿病和高血脂等指标正相关。
[0009]这表明GPNMB有可能作为治疗肥胖症等的药物靶点，既可以通过基因治 疗降低Gpnmb表达，也可以通过采用拮抗剂等抑制GPNMB蛋白活性。[0010]根据本发明的一个方面，减少Gpnmb基因表达包括但不限于抑制GPNMB 蛋白的编码基因的表达。例如，可给予抑制Gpnmb基因表达或降低其表达水平 的试剂，这些试剂包括：抑制Gpnmb基因转录活性的试剂，抑制Gpnmb mRNA 的转录水平的试剂，促进Gpnmb mRNA降解的试剂，针对Gpnmb基因的 siRNA，抑制Gpnmb mRNA的翻译的试剂，和特异性识别Gpnmb基因的导向 核酸并进行剪切以降低其水平的试剂，还可以是引起Gpnmb基因序列突变的试 剂，使得表达出来的GPNMB蛋白失活，如打靶载体。[0011]根据本发明的另一个方面，提供降低GPNMB蛋白活性的拮抗剂，可以是 例如特异性抗体或具有抑制活性的小分子。利用抗体中和GPNMB后发现，可 预防和治疗肥胖、脂肪堆积减少、血脂下降、能量代谢增强、胰岛素敏感性增 加、血液葡萄糖清除能力增强。[0012]根据本发明的再一个方面，以Gpnmb基因/GPNMB蛋白作分子指标，在 临床上用于诊断胰岛素抵抗、糖尿病、高血脂症、肥胖等代谢性疾病的病程发 展。检测Gpnmb基因或蛋白的试剂包括但不限于用于检测Gpnmb基因的各种 引物和探针，和/或用于检测GPNMB蛋白的特异性抗体等，这类试剂包括含 Gpnmb基因或蛋白的样品以及实施检测过程中使用的其它试剂，如溶剂等，包 括但不限于实施PCR等所需的各种试剂。
[0013]实验结果表明GPNMB蛋白和基因可以作为代谢性疾病诊断的指标与治疗 的靶点。附图说明
[0014]图1：腺相关病毒(AAV)过表达系统对肝分泌GPNMB上调白色脂肪组织 的产脂能力的功能研究；
[0015]a.体重检测；b.进食量；c.小鼠代谢参数；d.qPCR分析小鼠白色脂 肪的脂合成相关基因；e.小鼠氧气消耗量；f.棕色脂肪组织分化及产热相关基因 水平变化；g.血糖水平；h.血胰岛素水平；i.葡萄糖耐受实验；j.胰岛素耐受实验。[0016]图2：抗体中和血液GPNMB抵抗高脂饮食诱导肥胖的研究；[0017]a.抗体治疗食物诱导肥胖的示意图；b.day 18的小鼠体重；c.进食量；d. 白色脂肪组织重量；e.白色脂肪组织HE染色及细胞大小统计；f.白色脂肪组织 产脂相关基因的变化；g.小鼠氧气消耗量；h.小鼠呼吸熵；i.血胰岛素浓度；j. 血葡萄糖浓度；k.葡萄糖耐受实验；l.胰岛素耐受实验；m.棕色脂肪组织分化及 产热相关基因水平变化。[0018]图3：AAV特异敲低肝脏Gpnmb表达改善饮食诱导的肥胖的研究；[0019]a.实验流程图；b.肝脏的Gpnmb表达水平；c.Western blotting检测血清 中GPNMB的量；d.白色脂肪组织中脂肪合成相关基因的表达水平；e.白色脂肪 组织与棕色脂肪组织的产热相关基因的表达水平；f.代谢笼的小鼠氧气消耗量； g.葡萄糖耐受实验。[0020]图4：血液中GPNMB的浓度与肥胖及其相关代谢性疾病相关性的研究；[0021]a.chow diet或high-fat diet饲养小鼠4周后，WT和diet-induced-obesity
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说 明 书
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(DIO)小鼠的血清GPNMB浓度；b.8周大的WT和OB小鼠的血清GPNMB 浓度；c.肥胖人群(BMI>＝28)与非肥胖人群(BMI<28)中血清GPNMB浓度；d. 人群中血液GPNMB与BMI的相关性。[0022]具体实施方法
[0023]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0024]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0025]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图 限制根据本申请的示例性实施方式。
[0026]实施例1肝分泌的GPNMB能上调白色脂肪组织的产脂能力[0027]1.1定量PCR测定方法：
[0028]Quantitative-PCR测定小鼠肝分泌的GPNMB对白色脂肪组织的产脂能力 的影响，取小鼠进行实验处理后，杀小鼠，将组织转移到组织破碎管管中，随 后用于mRNA的提取、逆转录合成cDNA以及荧光实时定量PCR，具体步骤如 下：[0029]1.1.1、mRNA的提取和定量[0030]1)每1ml TRIzol中加入200μl的氯仿，涡旋仪上剧烈振荡混匀，室温静置 15分钟。[0031]2)4℃，13200rpm离心10分钟，转移500μl的上层水相至新的1.5ml Eppendorf管中。
[0032]3)每份样品中加入600μl异戊醇，来回颠倒混匀。[0033]4)4℃，13200rpm离心10分钟，弃去上清，管底可见乳白色RNA沉淀。 每份样品中加入1ml的70％乙醇(用DEPC处理过的去离子水稀释)，颠倒 混匀。[0034]5)4℃，13200rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀室温晾干，加入30μl DEPC处理过的去离子水，充分溶解。[0035]6)取2μl RNA到98μl水中，混匀后用分光光度计(Eppendorf)测定260 nm的光吸收值，计算样品浓度，测定260nm与280nm光吸收值的比值，计 算样品纯度，最终调整样品浓度为1μg/μl。
[0036]1.1.2、逆转录合成cDNA
[0037]cDNA合成采用Promega公司的M-MLV逆转录酶试剂盒。每50μl体系含 有4μg的RNA，1μg的OligodT，终浓度各为0.4mM的dNTP。[0038]1)每个0.2ml PCR管中，加入4μl浓度为1μg/μl的RNA，1μl 1μg/μl 的OligodT，15μl DEPC水，混匀。
[0039]2)70℃变性5分钟，冰上骤冷。[0040]3)每个反应体系中加入17μl DEPC水，10μl 5×MLV缓冲液，1μl dNTP (各10mM)，2μl M-MLV逆转录酶，混匀。[0041]4)37℃反应1小时。[0042]5)70℃变性10分钟。[0043]6)10℃降温5分钟，加入200μl水稀释cDNA。[0044]1.1.3、荧光实时定量PCR[0045]Realtime PCR采用盛元生物公司的Sharpvue 2x Universal qPCR Master Mix试剂。每20μl体系中，Sharpvue 2x Mix:10μl，终浓度为0.5μM的引物， 2μl模板cDNA(逆转录产物稀释4倍用)，用水补至20μl。反应体系配置好 后，混匀，每个样品3个复孔。在
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Stratagene Mx30005P实时荧光定量PCR 仪上按照以下程序运行：a.95℃热激活5分钟，b.95℃变性30秒，c.60℃退 火30秒，d.72℃延伸30秒，延伸结束后采集荧光信号，e.b-d循环40次，f. 溶解曲线分析：95℃15秒，60℃1分钟，以1％的速度上升到95℃，95℃持 续15秒，60℃上升到95℃的过程中采集荧光信号。运用比较Ct法计算mRNA 的相对含量(相对于Cyclophilin)，并以WT小鼠组标准化为1。本实施例中 荧光定量PCR采用的引物序列见表1。[0046]表1本实施例中荧光定量PCR所用引物的信息
[0047]
1.2葡萄糖耐受和胰岛素耐受试验测定方法：
[0049]实验进行之前，小鼠需要禁食预处理。葡萄糖耐受试验(Glucose tolerance test,GTT)禁食过夜，胰岛素耐受试验(Insulin tolerance test，ITT)禁食4小 时。在GTT实验中，腹腔注射2g/kg葡萄糖；ITT实验腹腔注射0.75U/kg胰 岛素(Sigma)。分别在15、30、60及120分钟时间点尾尖采血。用美国强生稳 豪血糖试纸测量血液葡萄糖浓度(Onetouch Ultra blood glucose monitoring systerm-LifeScan)。[0050]1.3代谢笼试验测定方法
[0051]对照组小鼠和实验组小鼠转移至综合性实验动物监视系统(Columbus Instruments,Columbus,OH)。在代谢笼内适应并按照仪器操作指南进行连续 监视，一直到实验数据呈现稳定状态。此过程大约耗时约24小时，这段时间被 称为动物适应期。此后仪器监测24–48小时内小鼠O2消耗体积、CO2生成体积 的变化以及运动情况。统计数据并计算呼吸熵(O2消耗体积：CO2生成体积)。
[0052]2.通过腺病毒载体在肝脏表达GPNMB胞外分泌段对小鼠的影响研究[0053]选用腺相关病毒过表达系统。AAV具有感染效率高、表达时效性长(最长达 6个月)以及免疫反应小等优点。小鼠GPNMB属于Ⅰ型分泌蛋白，包括574 个氨基酸残基，其中1-502氨基酸属于GPNMB胞外分泌段(ectodomain， ECD)。委托Obio Technology Co.,Ltd.(上海)构建腺病毒载体质粒，采用 pAOV-CMV-3×Flag载体，构建了AAV-CMV-Gpnmb-ECD-3×Flag质粒，并选 择包装成主要在肝脏表达的8型腺相关性病毒(AAV8-Gpnmb-ECD)。对小鼠进 行
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AAV8-Gpnmb-ECD注射，每只小鼠注射5×1011pfu的剂量。[0054]在注射1周后，喂食小鼠(本文中小鼠无特殊说明，则全为C57BL/6)60％ 的高脂饲料，在喂食过程中的不同时间点对小鼠的体重和进食量进行监测，发 现随着喂食时间延长，过表达GPNMB-ECD的小鼠体重同比增长比对照小鼠 (注射AAV8-对照病毒)快，并在注射4周后的检测点中出现明显差异，同时两 组之间的进食量没有显著变化(图1a,b)。代谢速率下降是肥胖小鼠的一个重 要指标，进而进行代谢笼功能性分析，结果显示过表达GPNMB-ECD小鼠的氧 耗量(VO2)下降，这表明小鼠的代谢率确实有所下降(图1e)。接下来， Quantitative-PCR分析了棕色脂肪组织的成脂分化基因(422/ap2)及促进能耗 产热的基因(Ucp-1)的表达，发现在脂肪细胞分化效率没有明显变化的前提下 产热基因明显下调(图1f)，这可能是代谢率下降的原因。同样，对小鼠白色 脂肪组织中的脂质合成基因(Srebp1c、Acs、Acc、Acl以及Fasn)进行了分 析，分析结果显示GPNMB-ECD促进了WAT中脂质合成相关基因显著上调(图 1d)。
[0055]分析小鼠的各项代谢指标结果显示(图1c)，两组小鼠均无明显炎症(谷丙 转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST))，实验组小鼠的体重明显增加，肝脏的重 量以及肝比重没有变化，脂肪组织的重量以及脂肪组织与体重的比重明显上调 且有统计差异，血清胆固醇以及甘油三酯的含量没有明显改变，然而血糖以及 胰岛素的含量显著上调。血糖和胰岛素水平的升高提示过表达GPNMB-ECD小 鼠可能存在胰岛素抵抗(图1g,h)。接下来的GTT和ITT实验也进一步证明了 我们的推测(图1i,j)。[0056]因此，在高脂诱导肥胖的过程中，过表达GPNMB-ECD小鼠的体重增加， 代谢率降低，产热减少，胰岛素抵抗加重。
[0057]实施例2抗体中和血液GPNMB能抵抗高脂饮食诱导肥胖[0058]测定方法与实施例1中一致[0059]2.1小鼠白色脂肪组织的HE染色[0060](1)小鼠白色脂肪组织取出后经过冷的PBS漂洗后置于4％PFA中固定 4小时；[0061](2)PBS洗3次；[0062](3)使用梯度乙醇脱水，二甲苯透明后包埋；[0063](4)使用莱卡石蜡切片机手动切片，切片厚度4-10m；[0064](5)贴片于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，37℃烤片过夜；[0065](6)进行HE染色。[0066]2.2 GPNMB中和抗体制备[0067]1)真核表达纯化Gb1蛋白，0.22μm滤膜过滤，得到不少于50mg真核 蛋白。[0068]2)第一天，第一次免疫，取1mg蛋白(2mg/mL)每只兔子与0.5mL完全 弗氏佐剂(Freundadjuvant)充分混合，乳化，在兔子背部皮下注射；[0069]3)第三天，第二次免疫。取1mg蛋白(2mg/mL)每只兔子与0.5mL完全 弗氏佐剂充分混合，乳化，在兔子背部皮下注射；[0070]4)第28天，第三次免疫。取1mg蛋白(2mg/mL)每只兔子与0.5mL不 完全弗氏佐剂充分混合，乳化，在兔子背部皮下注射；[0071]5)7天后，耳缘静脉采血，western blot检测抗体特异性；[0072]6)7天后，第四次免疫。取1mg蛋白(2mg/mL)每只兔子与0.5mL不完 全弗氏佐剂充
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分混合，乳化，在兔子背部皮下注射；[0073]7)以后每14天免疫一次，根据需要决定处死兔子采血时间，通常为5–7 次免疫后；[0074]8)当最后一次免疫后7–10天，颈动脉采血，每只兔子大约能够采集 50-100mL血浆左右；
[0075]9)全血4℃放置过夜，4℃，1500g离心15分钟，分离血清；[0076]10)Western Blot检测，选择较好的抗血清备用。
[0077]2.3给予GPNMB中和抗体对高脂饮食诱导肥胖的抵抗作用
[0078]对高脂饮食喂食4周的野生型小鼠腹腔注射GPNMB中和抗体。每3天注 射一次，在不同的时间点监测小鼠的体重及其它生理指标(图2a)。结果显示， 在进食量没有显著变化的前提下，中和GPNMB的小鼠同比对照组小鼠体重增 长减慢，并在注射后第6天呈现出差异，随着注射时间的延长，差异显著性增 加(图2b,c)。在从开始注射中和抗体后的第15天，对小鼠进行了代谢笼检测， 结果显示治疗组小鼠的代谢率(氧气消耗量VO2)显著上升(图2g,h)。分析 血糖水平和胰岛素的浓度，两者均有下调，这提示胰岛素抵抗可能得到了改善 (图2i,j)。一致的是，GTT和ITT检测结果显示中和GPNMB后的小鼠胰岛素 抵抗症状明显改善(图2k,l)。
[0079]对白色脂肪组织的脂质合成基因表达进行了检测，结果显示脂质合成相关 基因(Srebp1c、Acs、Acc、Acl以及Fasn)均有不同程度的下调，其中Fasn下 调最明显(图2f)，相应的脂肪组织的重量也明显减轻(图2d)，同时WAT石 蜡切片的HE染色结果显示脂肪细胞显著变小(图2e)。而棕色脂肪组织在脂肪 细胞分化效率没有明显变化的前提下产热基因(Ucp-1)明显上升，这可能是代谢 笼实验中代谢率上升的原因(图2m)。[0080]综上所述，抗体中和GPNMB能够增强饮食诱导肥胖小鼠的代谢率，增加 小鼠产热，降低白色脂肪组织脂质合成速率，改善胰岛素抵抗，最终抵抗高脂 饮食诱导的肥胖。[0081]实施例3AAV特异敲低肝脏Gpnmb表达能改善饮食诱导的肥胖[0082]测定方法同实施例1[0083]委托Obio Technology Co.,Ltd.(上海)构建腺病毒干扰载体，使用 pAKD-CMV-bGlobin-EGFP-H1-shRNA，构建了Gpnmb-shRNA(也写作 AAV8-Gpnmb-shRNA、AAV8-Gpnmb-shRNA、AAV-shGpnmb)。[0084]如图3a所示，使用AAV-Gpnmb-shRNA注射小鼠，介导表达的 Gpnmb-shRNA敲低了肝内的Gpnmb表达(图3a)。研究表明， AAV8-Gpnmb-shRNA能显著敲低肝内Gpnmb的表达(图3b)，进一步降低血 液中GPNMB的浓度。[0085]在从开始注射AAV的第二周后，对小鼠进行了代谢笼检测，结果显示治疗 组小鼠的代谢率显著上升(图3f)。GTT检测结果显示敲低肝内Gpnmb表达后 的小鼠胰岛素抵抗症状明显得到了改善(图3g)。
[0086]在敲低肝内Gpnmb表达后的小鼠的白色脂肪组织中，脂质合成相关基因 (Srebp1c、Acs、Acc、Acl以及Fasn)表达水平都有显著下降(图3d)。而在棕 色脂肪组织和腹股沟间脂肪中，产热相关的基因(Ucp-1)表达显著上升，这与前 面的代谢笼实验结果相符，表明小鼠的能量消耗增加(图3e)。[0087]此实施例证明，AAV8特异敲低肝脏Gpnmb表达也能增强饮食诱导肥胖小 鼠的代谢率，增加小鼠产热，降低白色脂肪组织脂质合成速率，改善胰岛素抵 抗，最终抵抗高脂饮食
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诱导的肥胖。
[0088]实施例4人群血液GPNMB浓度与肥胖及其相关代谢性疾病相关性分析[0089]为研究GPNMB与肥胖的关系,我们分析了DIO(diet-induced obesity)和 OB(obesity)小鼠血清中的GPNMB的浓度(图4a，b)，结果显示饮食诱导肥 胖小鼠和OB小鼠血清中GPNMB浓度显著高于各自的对照WT小鼠浓度。[0090]同样，我们收集了318例人血清样本，按照BMI值将人群分为肥胖组和非 肥胖组，通过ELISA分析发现肥胖患者体内的GPNMB含量显著高于非肥胖组 (图4c，d)。我们全面分析了血清中GPNMB的浓度与人类肥胖相关指标的关 系。在收集的318血清样本中(收集的不同BMI的人血清样本，均在收集血清前 未进行任何药物及手术治疗)，按照GPNMB的浓度分成三等分位，我们分析了 各个代谢指标随GPNMB浓度变化的关系，并做了统计分析(表2)。通过分析， 我们发现许多肥胖相关的指标(尤其是BMI和HOMA-IR)与GPNMB的浓度呈 正相关，并且关联紧密。[0091]因此，在正常生理条件下GPNMB存在于小鼠和人体中，并且血液中 GPNMB的浓度与肥胖及其相关代谢性疾病具有正相关性。
[0092]表2.不同BMI指数对象的Gpnmb(ng/ml)三分组的代谢物成分比较
[0093]
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显示的数据是中位数(范围).
[0095]*p<0.05vs.Low group(Gpnmb<10.16ng/mL)
[0096]BMI身体质量指数,WHR腰臀围比,WH腰围身高比,SBP收缩压,DBP舒张 压,TG甘油三酯,TC胆固醇,HDL‐C高密度脂蛋白胆固醇,LDL‐C低密度脂蛋白 胆固醇Ogtt口服葡萄糖耐受实验,HbA1C血红蛋白a1c,HOMA‐IR稳态模型评价 胰岛素抵抗.BMI>30的诊断为肥胖。[0097]附注：人GPNMB氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，即如下：[0098]Homo sapiens glycoprotein nmb(GPNMB)[0099]NM_001005340.1
[0100]
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序 列 表
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SEQUENCE LISTING<110> 武汉大学<120> 人肝脏分泌蛋白GPNMB或其拮抗剂或激动剂的用途<130> WH1954-17P121822<160> 15<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 572<212> PRT<213> Artificial<220><223> 人GPNMB氨基酸序列<400> 1Met Glu Cys Leu Tyr Tyr Phe Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Ala Arg1 5 10 15Leu Pro Leu Asp Ala Ala Lys Arg Phe His Asp Val Leu Gly Asn Glu 20 25 30Arg Pro Ser Ala Tyr Met Arg Glu His Asn Gln Leu Asn Gly Trp Ser 35 40 45Ser Asp Glu Asn Asp Trp Asn Glu Lys Leu Tyr Pro Val Trp Lys Arg 50 55 60Gly Asp Met Arg Trp Lys Asn Ser Trp Lys Gly Gly Arg Val Gln Ala65 70 75 80Val Leu Thr Ser Asp Ser Pro Ala Leu Val Gly Ser Asn Ile Thr Phe 85 90 95Ala Val Asn Leu Ile Phe Pro Arg Cys Gln Lys Glu Asp Ala Asn Gly 100 105 110Asn Ile Val Tyr Glu Lys Asn Cys Arg Asn Glu Ala Gly Leu Ser Ala 115 120 125Asp Pro Tyr Val Tyr Asn Trp Thr Ala Trp Ser Glu Asp Ser Asp Gly 130 135 140Glu Asn Gly Thr Gly Gln Ser His His Asn Val Phe Pro Asp Gly Lys145 150 155 160Pro Phe Pro His His Pro Gly Trp Arg Arg Trp Asn Phe Ile Tyr Val 165 170 175Phe His Thr Leu Gly Gln Tyr Phe Gln Lys Leu Gly Arg Cys Ser Val 180 185 190Arg Val Ser Val Asn Thr Ala Asn Val Thr Leu Gly Pro Gln Leu Met
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序 列 表
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195 200 205Glu Val Thr Val Tyr Arg Arg His Gly Arg Ala Tyr Val Pro Ile Ala 210 215 220Gln Val Lys Asp Val Tyr Val Val Thr Asp Gln Ile Pro Val Phe Val225 230 235 240Thr Met Phe Gln Lys Asn Asp Arg Asn Ser Ser Asp Glu Thr Phe Leu 245 250 255Lys Asp Leu Pro Ile Met Phe Asp Val Leu Ile His Asp Pro Ser His 260 265 270Phe Leu Asn Tyr Ser Thr Ile Asn Tyr Lys Trp Ser Phe Gly Asp Asn 275 280 285Thr Gly Leu Phe Val Ser Thr Asn His Thr Val Asn His Thr Tyr Val 290 295 300Leu Asn Gly Thr Phe Ser Leu Asn Leu Thr Val Lys Ala Ala Ala Pro305 310 315 320Gly Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Ser Lys Pro Thr 325 330 335Pro Ser Leu Ala Thr Thr Leu Lys Ser Tyr Asp Ser Asn Thr Pro Gly 340 345 350Pro Ala Gly Asp Asn Pro Leu Glu Leu Ser Arg Ile Pro Asp Glu Asn 355 360 365Cys Gln Ile Asn Arg Tyr Gly His Phe Gln Ala Thr Ile Thr Ile Val 370 375 380Glu Gly Ile Leu Glu Val Asn Ile Ile Gln Met Thr Asp Val Leu Met385 390 395 400Pro Val Pro Trp Pro Glu Ser Ser Leu Ile Asp Phe Val Val Thr Cys 405 410 415Gln Gly Ser Ile Pro Thr Glu Val Cys Thr Ile Ile Ser Asp Pro Thr 420 425 430Cys Glu Ile Thr Gln Asn Thr Val Cys Ser Pro Val Asp Val Asp Glu 435 440 445Met Cys Leu Leu Thr Val Arg Arg Thr Phe Asn Gly Ser Gly Thr Tyr 450 455 460Cys Val Asn Leu Thr Leu Gly Asp Asp Thr Ser Leu Ala Leu Thr Ser465 470 475 480Thr Leu Ile Ser Val Pro Asp Arg Asp Pro Ala Ser Pro Leu Arg Met 485 490 495Ala Asn Ser Ala Leu Ile Ser Val Gly Cys Leu Ala Ile Phe Val Thr 500 505 510
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序 列 表
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Val Ile Ser Leu Leu Val Tyr Lys Lys His Lys Glu Tyr Asn Pro Ile 515 520 525Glu Asn Ser Pro Gly Asn Val Val Arg Ser Lys Gly Leu Ser Val Phe 530 535 540Leu Asn Arg Ala Lys Ala Val Phe Phe Pro Gly Asn Gln Glu Lys Asp545 550 555 560Pro Leu Leu Lys Asn Gln Glu Phe Lys Gly Val Ser 565 570<210> 2<211> 20<212> DNA<213> Artificial<220><223> 小鼠Srebp1c基因的正向引物<400> 2ggagccatgg attgcacatt 20<210> 3<211> 18<212> DNA<213> Artificial<220><223> 小鼠Srebp1c基因的反向引物<400> 3ggcccgggaa gtcactgt 18<210> 4<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220><223> 小鼠Fasn基因的正向引物<400> 4gctgcggaaa cttcaggaaa t 21<210> 5<211> 23<212> DNA<213> Artificial<220><223> 小鼠Fasn基因的反向引物<400> 5
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agagacgtgt cactcctgga ctt 23<210> 6<211> 17<212> DNA<213> Artificial<220><223> 小鼠Acs基因的正向引物<400> 6gctgccgacg ggatcag 17<210> 7<211> 23<212> DNA<213> Artificial<220><223> 小鼠Acs基因的反向引物<400> 7tccagacaca ttgagcatgt cat 23<210> 8<211> 23<212> DNA<213> Artificial<220><223> 小鼠Acc基因的正向引物<400> 8tgacagactg atcgcagaga aag 23<210> 9<211> 18<212> DNA<213> Artificial<220><223> 小鼠Acc基因的反向引物<400> 9tggagagccc cacacaca 18<210> 10<211> 17<212> DNA<213> Artificial<220><223> 小鼠Acl基因的正向引物
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<400> 10gccagcggga gcacatc 17<210> 11<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220><223> 小鼠Acl基因的反向引物<400> 11ctttgcaggt gccacttcat c 21<210> 12<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220><223> 小鼠Lce基因的正向引物<400> 12agagaacacg tagcgactcc g 21<210> 13<211> 22<212> DNA<213> Artificial<220><223> 小鼠Lce基因的反向引物<400> 13accaccaaag ataaaggcag cg 22<210> 14<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220><223> 小鼠Cyclophilin基因的正向引物<400> 14tggagagcac caagacagac a 21<210> 15<211> 19<212> DNA<213> Artificial<220>
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<223> 小鼠Cyclophilin基因的反向引物<400> 15tgccggagtc gacaatgat 19
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图1
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