基于QuEChERS的液相色谱

基于QuEChERS的液相色谱 - 串联质谱多残留农药分析光谱法的发展和实验室间验证 一种高通量，QuEChERS（快速，简便，廉价，高效，耐用，安全）的样品制备和液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）分析方法在对191种农药在植被和水果样本的测定中已开发和验证。使用相同的LC色谱柱和MS / MS仪器和操作参数，这种方法在美国食品和药物管理局（FDA），国家葡萄研究中心（NRCG），印度，省和安大略省环境部（教育部）实验室进行了评估。方法验证结果表明，但190农药可以通过仪器检测限（IDL）在兆分之一（PPT）范围内的LC-MS/MS分析。基质依赖IDL的研究表明，由于无论是低离子化效率或基体效应的发挥，这191种农药中的14个不能用这种方法分析。三个实验室使用四个复制的样本基质（N = 4时）测定方法回收率（％R）和方法检测限（MDLS）。 ％R数据的> 79％来自加强研究范围从80到120％，MDLS在十亿分之一范围内测定 > 94％的MDLs范围从0.5到5 ppb十亿分之一。采用此方法产生样品的分析表明，两个多反应监测（MRM）的转换可能没有足够提供100％的真正目标农药的正确识别，然而，从三个实验室获得的定量结果只有一个很好的匹配十亿分之一低水平的一些差异。 ％R数据加强研究主成分分析，结果显示，多数的％R下降到80％<%R <120％集群。由于人参和桃对基体效应的发挥，异常值以10和25 ppb的最低峰水平被观测到。这项研究还表明，QuEChERS试剂样品一经制备或冷冻储存就尽快分析，以避免对评估分析物产生任何不利影响。 引言 1984年一个大气压电离源（1）的设计导致基于液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）仪器（2）的电喷雾电离（ESI）在1989年的发展。LC - MS/ MS的实用性彻底改革了用于分析热不稳定和/或非易失性的有机分子，其中包括 药物活性的化合物，兽药，抗生素和杀虫剂（3-5）的分析方法。国有的最先进的LC-MS/MS仪器具有超高的灵敏度，并允许至少50 种杀虫剂的同时分析并具有卓越的数据质量和效率（ 4，6，7）大型的LC-MS/MS方法的发展。这伴随着基于人工智能的数据采集软件的实现，如多反应监测（预定MRM）的，动态的MRM实施，并定时选择反应监测（8），允许对许多农药能有效测定的LC-MS/MS方法的发展。 本文LC-MS/MS-based，对191种农药残留量的测量，包括氨基甲酸盐，极性有机磷，苯基脲，苯胺，苯甲酰phenylureas，conazoles，大环内酯，吡虫啉，strobilurines，和三嗪的多残留方法描述。使用QuEChERS试剂萃取过程（9），在三个实验室利用类似的液相色谱流动相，梯度洗脱分离，同一ESI和MS / MS的工作参数的分析方法进行了验证。强化配方研究样本是使用橘子，桃子，菠菜，人参测定方法检测限（MDL）和水平测试，使用橘子，桃子，菠菜，和人参样品的实验室。 本文还记载性能和验证数据如LC-MS/MS方法的短期稳定性， 仪器检测限（IDLs），基质依赖IDL（MD - IDL），方法检测限（MDLS）测定使用的美国环境保护署（US EPA） 方案（12）。另外的方法验证和质量控制和质量保证（QC / QA）的数据，我们还调查了用于重组样品的LC-MS/MS分析之前的溶剂的效果。使用主成分分析（PCA）算法，我们也评估方法的回收率从三个实验室获得的数据来证明他们的相似性和适用性实验室用一个单一的LC - MS /MS方法实验室间验证。从排定的MRM数据采集算法，使用两个MRM的转换，以确定目标农药的有效性得到的分析结果化合物的质量目标化合物的光谱鉴定（10），以满足欧盟标准，需要使用其他技术，以确保真正的积极鉴定目标农药将被讨论。 实验步骤 化学品。大多数的农药标准取自美国环保局农药库（英尺美德，MD），而其他Fluka公司/ Aldrich公司（圣路易斯，密苏里州）和光化工美国（里士满，弗吉尼亚州）获得通过，并列入提供信息表S1。甲醇，乙腈，HPLC级水，甲酸，甲酸铵，无水MgSO4和NaCl分别购自尔科技（宾夕法尼亚州匹兹堡）。六氘（2H） 同位素标记的内部标准（ILIS）辅助资料表S1中列出购买CDN的同位素（蒙特利尔，QC，加拿大）。通过一个Barnstead NANOpure水净化系统，反渗透水生产高品质的水（纯净水）用于制备方法空白和方法峰样本。 QuEChERS试剂产品，（1）4克无水硫酸镁，1克无水醋酸钠，和50 mL离心管，（2）15 mL离心管中含有1.2克无水硫酸镁和400毫克的主要二级胺（PSA ）吸附剂，均购自美国化学技术（布里斯托尔，PA）。干和粉状人参样品，西洋参（西洋参），用于制备空白和基质匹配标准提供威斯康辛州花旗参委员会（沃索，威斯康星州）。桃，橘子，菠菜，和人参是从市场购买散装包。 分析标准的独立的储备溶液，包括那些为ILIS，准备个别化合物称量每次10-75毫克，并在10或25 mL乙腈，甲醇，或在体积的甲醇/水（50:50 V / V）中容量瓶或刻度塑料管（Simport，QC，加拿大）溶解。中间溶液通过混合储备液在100 mL容量瓶中制备。，通过使用浓度1，5，10，50和100 ppb的样品基质提取物和基质缓冲液（20毫米酸铵）五个水平的基质匹配校准用标准从中间溶液制备。 在样品制备之前加入ILIS溶液，并在定量分析中作内标使用。 样品制备。四种不同的样品基质（橙，桃，菠菜，和人参）在方法验证阶段使用。 在学院公园，MD FDA实验室样品制备，并在FDA，安大略省环境部（MOE），葡萄国家研究中心（NRCG）实验室分析。对于橘子，桃子，菠菜样品基质，强化样品制备一式四份，由10±0.1 gcryoground样品在50毫升一次性螺丝帽聚丙烯离心瓶（热尔科技，加利福尼亚州圣何塞）。0.5ml 5，2，0.5，和 0.2 百万分之一峰溶液加入到每个样品管，达到强化水平为0.25，0.10，0.025和0.010 ppm。每次50 mL样品管振荡3分钟，获得均匀的样品，在加入10毫升1％乙酸/乙腈，无水MgSO4 4克，无水醋酸钠1克。后的样品已经由手动摇，200μL替代溶液钢珠分别加入到每个样品，样品管上GenoGrinder研磨机机械振动筛（SPEX样品制备，有限责任公司，Metuchen，NJ）放置1分钟在1000次/分钟。样品离心5分钟4500转每分。 最终提取物（〜9毫升）被转移到离心管含有300毫克的PSA吸附剂和硫酸镁900毫克。样品管被振动GenoGrinder为1分钟（500次/分钟），并在5分钟4500转离心。样品提取液从离心管（约6.5-7.0毫升恢复），转移到2 mL样品瓶，并在冰袋上的冷却器发送到加拿大和印度的实验室。样品36小时抵达MOE，而发送到印度的在海关延迟超过168小时。 在收到样品提取物，每个实验室的工作人员准备了5个不同水平进行分析的基质匹配校准标准。这是通过混合300μL0.333，0.167，0.067，0.033，0.0167 PPM标准溶液与200μL空白基质提取和500μL的样品缓冲液（20毫米酸铵），溶液直接用于MS / MS分析。样品缓冲液500μL在LC-MS/MS分析之前加入，以确保分析物的完整性。强化样品通过用300μL乙腈和500μL样品缓冲液稀释200μL样品提取物在50，20，5，2 ppb水平分析之前制备。 强化人参样品制备使用1.0±0.05克 50μL5，2，和0.5 PPM穗的解决方案，以最终浓度为0.25，0.10和0.025 ppm的人参进补。样品振荡10 s，并允许设置前10 ml，用HPLC级水增加。增加了一个钢珠人参水的混合物，样品在1000次/分钟的GenoGrinder动摇 前1分钟，乙腈和盐此外。基质匹配的标准人参空白提取物400μL加入100μL，1.6，0.8，0.333，0.167，0.067，0.033 ppm的标准解决方案，并准备 样品基质缓冲液500μL加入分析前实现基质匹配校准标准160，80，33.3，16.7，6.67，3.33， 1.67 ppb的分别。 样品阴天和在这个阶段，直接进入立法会自动采样瓶使用0.2微米的尼龙膜过滤器（孙斯里兰卡，洛克伍德，TN）筛选。筛选样品是明确的，可以存放在一个冰柜，直到进行分析。 仪器和数据分析。液相色谱分离 TION达到使用岛津Prominence/20系列（哥伦比亚，MD）系统，在FDA，教育部和NRCG实验室。液相色谱系统接口的AB Sciex公司（CA），4000 Q阱质谱仪通过ESI接口（IonSpray）。预定的MRM数据被捕获和处理所有化合物在正离子模式。每个农药使用了两个具体的MRM转换来实现的识别点（IP）在发生样品的目标农药鉴定 4（10，11）。量化进行了使用无论是外部标准校正（NRCG）或内部标准校正（FDA和教育部） 2010年下半年，二嗪农，作为内部标准。从氮气发生器（帕克Balston，黑弗里尔，马萨诸塞州）的99％纯度的气体氮在ESI 源和碰撞细胞。在分析中使用一个雷斯德LC柱（贝尔丰特，PA;超水溶液，C - 18，100 × 2.1毫米，3微米）和保护柱（超水溶液，C - 18墨盒，10 × 2.1毫米后卫盒支架） 。流动相，柱温，进样量，流速，在离职的LC梯度参数列于表1。窗帘，碰撞，雾化器，辅助气体和ESI源的源的温度分别设定为15，6，35和45 psi和450℃。离子喷雾电压5200。分簇的潜力（DP），碰撞能量 （CE）和碰撞池出口潜力（CXP）进行了优化直接输注，和两个最激烈的每个待测离子对分析选择。 DP，CE认证，CXP和两个具体的，最激烈的MRM对值被列在支持信息表S1和用于预定的MRM的数据采集。主成分分析（PCA）进行了使用Infometrix Pirouette4（Bothell的，WA）。

结果与讨论 图1显示了在此方法中的农药和评估ILISs重建色谱。这些农药有广泛的分子量之间广泛的极性 179和920。因此，指望这些农药的溶解度，在最终提取与使用的溶剂不同， 影响色谱的质量。这是最好的证明 在图1甲醇/水70:30（一）使用不同的成分，以30:70（B）在样品的色谱峰形变化。最戏剧性的变化，观察那些极极流出，在第4分钟的分析。因此，在最终提取物的LC - MS / MS分析，至少有70％的水溶剂使用，以确保良好的色谱峰形。 演奏。仪器内的运行精度 （4.5 H股，N=12）获得的相对标准偏差 （RSD）为8 ppb的标准溶液，在12个连续分析 4 h和支持信息表S1上市。 根据美国环保局的协议（12）使用从连续12个分析，1和8个ppb的校准标准获得每个分析物的标准偏差（SD）的仪器检测限（IDL）来计算。 SD卡是一个关键t0.010 =乘以 2.718（自由度（DF）11）获得的IDL。矩阵

依赖IDLs（MD - IDL）通过分析八个复制的浓度在1，2，5四个矩阵，并 10 PPB（桃，橙，菠菜），1.67，3.34，8.35，和

16.7 PPB（人参）。由于基体效应，并根据样品基质，有些农药没有检测到的最低水平（1或1.67 ppb的），并从下一个更高级别的分析数据。 MD - IDLs，然后计算每个待测SD乘以2.99（t0.010，DF = 7）和上市的支持信息，为四个矩阵表S1。

支持信息表S1演示的方法固有的坚固性，这使得三个LC-MS/MS系统，以提供优良的短期（4.5小时，N = 12）5％的精度RSD为大多数（> 80％）的化合物的研究。不到10％的191个化合物

研究过的10％或更高的短期RSD。 IDL的价值观为每一个目标的农药进行了测定低到每万亿美元的水平高部位，使用这种短期的稳定数据。使用

类似的方法，价值观的MD - IDL（N = 8）也确定中等万亿部分，以每亿美元的水平低部分。值得注意的是IDL的值派生通过美国EPA协议，他们应该被视为保守认为可能是10倍，高于通过信号噪声比（SNR）的方法产生的。美国EPA协议等使用，也形成了三个实验室进行后续实验，以作比较一致的基准。

从辅助资料表一中列出的值的仪器短期RSD，你会发现只有一个化合物（即，阿维菌素B1B）的LC-MS/MS分析和nondetectable（ND）上市。余下的190农药17人不等的劣质精密度

12％至63％。 RSD为获得一个校准标准，从样品基质的影响，这些劣质精密度只能归因于这些低电离效率 17种农药。因此，人们会期望这些MD - IDLs

17化合物比其他的目标农药差。可以看出，在表S1的支持信息，14

191农药（以黄色突出显示），无法在基质匹配的标准衡量。这些都是上市作为nondetectable

（ND），并没有进一步评估。值得注意的是，六个这些ND农药（杀虫剂47，48，92，139，152和182号）有优越

的RSD（1.8-4.5％），因为矩阵施加的影响，我们不能确定他们的MD - IDL的。新城疫的原因

其他七个农药（农药11，60，104，105，112，128和181），可能是由于分析物的不稳定，低电离效率，和基体效应的组合。

农药12，20，35，44，64，72，99，106，137和150的RSD值> 10％，但矩阵研究的影响较小。这些农药有一个可以接受的MD - IDL，并进行了评估 进一步。

方法验证。每三个实验室橙，桃，以及四个层次，并在三个层面强化人参强化菠菜样品进行分析，在浓度10至 250 ppb的。四个复制的每个设防水平进行了分析，共产生60方法验证样本。 FDA和教育部实验室作为内部D10 -二嗪农

标准进行定量分析，而NRCG用于定量分析的外部校准。使用5个级别的基质匹配校准标准，校准曲线 正视最少安装到1 / C加权（C为每个校准标准溶液的浓度方程的相关系数> 0.99）二次。这些曲线被用于

在各自的样品基质中的目标分析物的定量测定。平均方法回收率（％R，N = 4）和在不同的设防水平的目标化合物的SD中列出

表S2 - S5的支持信息。 RSD值> 10％的九个农药强调在这四个表中的黄色。 从三个实验室获得的％R，我们注意到 FDA，教育部和NRCG实验室，分别

90.4，79.6，177目标分析物回收80，共有79.8％的目标有80％和120％之间％的R值分析物和120％，和69.8％。这是总结在表2。作为同一样品，液相色谱柱，由精通每个实验室的分析师MS操作参数，一个可能的属性下面讨论的原因，这些不同的回收率。

从表1，我们注意到，NRCG，教育部和FDA 实验室使用的流速为0.3，0.35，0.5毫升/分，实现了液相色谱分离。这将使FDA的实验室窄立法会的山峰，更高的峰值强度和优异的信号噪声比（SNR），分析。从FDA的分析数据，将有更高的精度和准确度比其他两个实验室，更好的恢复数据。将需要额外的验证工作，支持这个道理。 第二个可能性，可能是外部标准校正 NRCG实验室所使用的量化方法。这可能部分解释为什么只有69.8％NRCG％R进入80-120％的范围内下跌。第三种可能性会被样品提取物的储存条件和保温时间。 FDA的实验室制备和分析这些样本提取后立即提取。 NRCG实验室和教育部开始准备和分析他们的样品，分别在168和36 h后样品提取。冷却器样品中提取出货量在温度<12° C至教育部和NRCG实验室，并准备和分析>48 >180 h后提取。在样品运输和储存条件的不确定性会导致更多的观测到的％R差异。 S2- S5从表中可以看到，所有三个实验室 困难分析复制“非常低的尖峰”和“低 秒杀“的菠菜和人参矩阵％的平均R和他们各自的SD证明。四个样本矩阵显示较差，RSD（以黄色突出显示）的九个农药的影响最小。 使用最低的SD obtainedAs从表S2 - S5可以看出，所有三个实验室已经“非常低的尖峰”和“低秒杀”菠菜和GI的困难，分析从实验中设防复制（表S2 - S5的配套信息），MDL 每个农药在95％置信水平计算 根据美国EPA协议和这些都列在表的支持信息S6。根据表现在三个实验室，基体效应，和样本条件仪器仪表，一些农药不能设防的最低水平（10 ppb）的检测，并从下一个更高级别的标准差获得使用了。的MDL，然后计算每个待测指定的SD乘以一个关键t0.050 = 2.353（n = 4）。这些MDLS一个详细的分析表明，可以实现所有三个实验室的分析物的25.1％，每亿美元的MDL一个子部分，从1到5 ppb的MDLS多数（68.7％），只有一小部分（6.2 ％）MDLS> 5 PPB。 ％R数据的性能，每个实验室的性能详列于表2。 主成分分析方法验证数据。由于大量的％R数据，复杂的基体效应，以及相关的不确定性与分离段米，我们用PCA探索对这些数据的属性（13）。这是通过从三个实验室（60个样品/共180样本的实验室）获得的177种农药在四个矩阵的各个设防水平的数据相结合的％R。数据集还包括一类（分类）变量代表源样本。 Pirouette 4被用来进行PCA和自动选择最佳的因素，将代表整个数据集。 ％R值对应的最佳因素进行聚类分析（HCA）和代的集群模式，观察分析可能离群。在目前的研究中，我们使用的因素，将占到约80％，总的分析物的数据集，实现了更好地理解。 如上所述，从美国FDA和教育部实验室的％R数据获得使用内部的标准量化，将有内在的一致性（相似性），除非由低电离效率和基体效应的影响，首先被用来表征％R图2A显示从PCA的第9因素为代表的98个样本（81.4％）的差异。正如预期的那样，这些样本大部分聚集在一起，表明在这98个样本的177个分析物类似的回收率。被视为离群值标记的样本包括教育部（蓝色）和FDA（绿色）在25 ng / g和教育部菠菜和FDA桃加在10 ppb的人参加标样品。 25纳克/克人参设防样品的两个个别联网表现出与这个特定的样品基质分析困难，与FDA和教育部表现出一定的难度，分别分析菠菜和橙样品基质。图2b显示％，81.4％，这些数据集的R数据（加载）的贡献。标记离群如alanycarb（5），阿维菌素B1a1（12），bifenazate（19），HYDRA - methylnon（96），霜霉威（147），螺（164），杀草丹（180），由于其较高或较低的回收率（>130或<70％），比在正常范围％R贡献的高得多的贡献（加载）结果显示从表S2- S5的支持以及信息的匹配意见。 使用相同的方法，从三个实验室的％R数据进行了分析，结果如图3所示。方差 80.4％（145个样本）为代表的第12因素 图3A所示。引进NRCG数据，这是从外部校准定量，改变某些特征的数据集。 然而，大多数的样品仍然聚集在一起，说明类似的回收率由三个分析这些145样本为177个组分 实验室。教育部和NRCG数据的％R（记“的作业系统*”和“NS *”图3A），远远超过对FDA的数据（记“FS *”）施加明显。菠菜基质的影响这是一个很好的迹象，菠菜产生更高的水平比其他三个矩阵的基体效应。桃矩阵也NRCG，在FDA和教育部的数据，并没有观察到可能是由于贮存时间的延长样品的NRCG样品数据产生一定的基体效应。在教育部的数据橙色矩阵所产生的基质效应依然大致相同。图3b显示如图3a所示的145个样本中的177个待测物所得的％R负荷。此外，以观察在FDA /教育部的数据集离群，我们还观察到的农药涕灭威砜（6），benfuracarb（17），（67）ethiprole，formaetanate盐酸（89），抑霉唑（97），螺（164）和噻菌灵（180），为离群。 从表2，美国FDA /教育部报告其范围从80到120％的％R的85.1％，而美国FDA /教育部/ NRCG 79.6％的％R在同一范围内。这结果 79.6％会更好NRCG实验室有机会提前收到他们的样品，以及使用内部的量化标准校准。这是很难解释的因素，可以用来表示FDA /教育部或FDA /教育部/ NRCG数据集;，然而，PCA和HCA结果表明，多数样品的分析集中以最小的离群。此外，它也是合乎逻辑的假设，FDA /教育部的数据集是受高达32的因素（％R数据从两个实验室分析四个设防水平的4个样品基质）和FDA /教育部/ NRCG数据可能多达48个因素的影响。 可以用来分别代表中，9日和11项因素，81.4％的FDA/教育部和79.4％的FDA/教育部/ NRCG数据集的事实表明，在％R很大的相似性因此，人们会得出结论的QuEChERS试剂基于LC- MS / MS方法这里描述的是坚固的三个实验室足以取得可比的分析数据。 结果发生的样本。从各种渠道收集的抢样品准备在复制和使用相同的过程中所述的三个实验室分析 以上。共两种人参粉，橙，和两个菠菜样品（N = 4时，每个样品）和5个桃样品（n =3）对每一个样品制备和分析。随着 除两个菠菜和一个桃子样品，我们发现在其他8个样品的浓度从1到365 ppb的各种农药。少数服从多数 FDA和教育部之间的定量结果符合很好。正如预期的那样，NRCG获得定量结果相比，那些表现出更高水平的差异时 由于使用外部标准校正定量，获得FDA和教育部。这些结果列于表3。 值得注意的是，尽管两个MRM的转换使用 为确定目标农药，有观察报告的结果之间的差异，说明有可能是三个实验室获得的假阴性或假阳性结果的比例很高。在每亿美元之间的下部，在所有分析的矩阵，这些数据和建议，确认这些分析物使用的其他技术可能是有益的的 这些措施包括产品离子谱库搜索（14）或高清晰度的测量，

精确的质谱分析（15），以实现所需的真阳性的识别。 感谢 我们感谢国环保局国家农药标准的资源库（英尺美德，MD），提供农药标准品，博士B. Wittrig雷斯德公司（贝尔丰特，PA）提供在这项工作中所使用的分析列威斯康辛州花旗参委员会（沃索威斯康星州）提供空白样品人参，博士和PG Adsule（董事，NRCG）和J. Odumeru（博士，化验服务处主任，教育部）在开展这项工作的支持。

支持信息：更多细节的目标农药，MRM的过渡，仪器的性能数据，如IDL和MD - IDL，为每个农药，使用四个不同的矩阵的177种农药MDLS强化样品所产生的验证数据每个矩阵。这种材料是可以免费通过互联网在http:// pubs.acs.org。