一种改进大肠杆菌DH5α转化效率的方法

安徽农业科学，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｎｈｕｉ　Ａｇ６．Ｓｃｉ．２００９，３７（２２）：１０４２０，１０４２３　责任编辑罗芸责任校对施倩倩　种改进大肠杆菌ＤＨ５ｃ￣转化效率的方法　杜红旗，李晨阳　，田璐　（郑州轻工业学院，河南郑州４５０００２）　摘要［目的］提高大肠杆菌ＤＨ５ｃ￣转化效率。［方法］在其他条件一致的情况下，将５　的质粒或连接产物加入含有１００　Ｉｘｌ的感受态　０．２　ｍｌ　ＰＣＲ管和１．５　ｎｌｌ的离心管中，Ｏ．２　ｍｌ　ＰＣＲ管设置热休克时间梯度和１．５　ｍｌ的离心管热休克时间９０　ｓ，对大肠杆菌ＤＨ　转化效　率进行了比较。［结果］Ｏ．２　ｍｌ　ＰＣＲ管转化效率高于１．５　ｍｌ的离心管，且０．２　ｍｌ　ＰＣＲ管热休克３０　ｓ时最高。［结论］采用此方法提高了　大肠杆菌ＤＨ５ａ的转化效率。　关键词离心管；感受态；ＣａＣ１　；热休克；转化　中图分类号Ｓ１８８　文献标识码Ａ　文章编号０５１７—６６１１（２００９）２２—１０４２０—０１　Ａ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　Ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ　ｏｆＥ　ｃｏｌｉ　Ｄｌ｛５　ＤＵ　Ｈｏｎｇ·ｑｉ　ｅｔ　８１　（Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｉｇｈｔ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｈｅｎａｎ　４５０００２）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　『Ｏｂ｛ｅｃｔｉｖｅ　１　Ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｉｍｅｄ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　Ｅ．ｃｏｌ　ＤＨ５　．１　Ｍｅｔｈｏｄ　ｌ　Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｏｔｈｅｒ　ｃｏｎｄｉ—　ｔｉｏｎｓ，５　ｐｌａｓｍｉｄ　ｏｒ　ｌｅｇａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｗａｓ　ａｄｄｅｄ　ｉｎｔｏ　０．２　ｍｌ　ＰＣＲ　ｔｕｂｅ　ａｎｄ　１．５　ｍｌ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　ｔｕｂｅ　ｗｉｔｈ　１００　ｔｚｌ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅｍ．Ｉｎ　ｄｉⅡｅｒ－　ｅｎｔ山ｅｌＴｌｌａｌ　ｓｈｏｃｋ　ｔｉｍｅ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ｏｔ　ｗａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ．１　Ｒｅｓｕｈ　ｌ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ　ｗｉｔｈ　０．２　ｍｌ　ＰＲＣ　ｒｅｆｏｌｑ＇ｎｅｒ　ｔｕｂｅ　ｉｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｗｉｔｈ　１．５　ｃｅｎｔｉｒｆｕｇｅ　ｔｕｂｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　０．２　ｍ１　ＰＣＲ　ｒｅｆｏｒｍｅｒ　ｔｕｂｅ　ｗｉｔｈ　３０　ｓｅｃｏｎｄｓ’ｔｈｅｒｍａｌ　ｓｈｏｃｋ　ｔｉｍｅ　ｇｉｙｅｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｐｅｒ－　ｆｏｒｍａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．１　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｉ　ｒｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５　０Ｉ　ｉｓ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｂｙ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　ｔｕｂｅ：Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ；ＣａＣ１，：Ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ；Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　转化是分子克隆中最常用的关键技术之一。转化效率　和酶切片段，用Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ连接４　ｈ后待转化。　的高低直接影响到前后实验的进展和工作效率。１９７２和　１．２．３转化步骤。ｌ：１　０００稀释的ＰｂＬｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒，吸取３０　１９７３年ＣＯｈｅｎ　－２］用ＣａＣ１，法成功地将Ｒ因子和重组质粒　１分别加入到６００　ｉｘｌ的ＤＩｌ５ｏ￣感受态中，混合均匀后，分别　ＤＮＡ导人大肠杆菌细胞。但由于转化是个很复杂的过程，具　吸取１０５　Ｉｘｌ加入到４个标有１、２、３、４的０．２　ｍｌ　ＰＣＲ管和１　体的作用机理仍在探究中。此后，ＣａＣ１：法作为一项经典转　个１．５　ｍｌ的离心管中，将４个离心管放入冰水混合物中吸附　化技术沿用至今，其间虽有小的改进，但都在菌的生理状　３０　ｒａｉｎ后，同时放人４２℃水浴热休克。５个处理样品：①０．２　态　］、菌的数量　］、冰浴时间　等方面进行研究。笔者从　ｍｌ　ＰＣＲ管热休克２０　ｓ；②０．２　ｍｌ　ＰＣＲ管热休克３０　ｓ；③０．２　转化所用的材料和热休克时间上对ＣａＣ１：法进行了初步的　ｍｌ　ＰＣＲ管热休克６０　ｓ；④０．２　ｍｌ　ＰＣＲ管热休克９Ｏ　ｓ；⑤１．５　探讨。　ｒｎｌ离心管热休克９０　ｓ。样品热休克后均冰浴２　ｍｉｎ，再分别　１材料与方法　加入４ＯＯ　ｔｘｌ的ＬＢ液体培养基，３７℃下２５０　ｒ／ｍｉｎ复苏４５　１．１试验材料　菌株、质粒和基因片段：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ｃｔ，　ｍｉｎ后吸取５Ｏ　ｌ涂到有氨苄青霉素的ＬＢ培养基平板上，涂　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋／一），由郑州轻工业学院实验室保存。所用试　布好后放人３７℃培养箱中培养过夜。连接产物转化同质粒　剂均为进口分析纯；ＬＢ培养基、氨苄青霉素溶液、０．１　ｍｏｌ／Ｌ　转化步骤，只是将３０　ｌ稀释的质粒换成３０　的连接产物　ＣａＣ１　溶液，均按《分子克隆实验指南》的要求配制；ＢａｍＨ　Ｉ、　和在最后将全部转化的细胞涂到含有氨苄青霉素的ＬＢ培养　ＥｃｏＲ　Ｉ、Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ购自宝生物工程（大连）有限公司。　基平板上。　ＧｅｎＣｌｅａｎ琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒，购于上海捷瑞生物　１．２．４计数。第２天取出平板计数和计算。　工程有限公司；０．２　ｍｌ　ＰＣＲ管和１．５　ｍｌ的离心管，购白海门　２结果与分析　市耀华玻塑仪器厂。　表１显示了不同热休克时间对大肠杆菌ＤＨ５ａ转化率　１．２试验方法　的影响。连接产物转化ＤＨ５ａ铺平板后的转化效率表明：处　１．２．１大肠杆菌感受态的制备。分别从平板上挑取ＤＨ５ｃ￣　理（样品）１—５的每板克隆数分别为１１２、２３４、２５９、１６６和　单个菌落到含有３　ｍｌ　ＬＢ试管培养基中，３７　ｃｃ下２５０　ｒ／ｍｉｎ　１８３。该实验用大肠杆菌ＤＨ５ｃｔ对转化所用不同容器和不同　培养过夜；按１：１００接种于５　ｍｌ　ＬＢ试管培养基中，３７℃下　热休克时间的转化效率进行了对比，结果表明：Ｏ．２　ｍｌ　ＰＣＲ　２５０　ｒ／ｒａｉｎ培养至对数生长期（ＯＤ　约０．４００）；取出放人冰　管转化效率明显高于１．５　ｍｌ的离心管；在０．２　ｍｌＰＣＲ管最　水混合物中冰浴１０　ｍｉｎ，分到１．５　ｒｎｌ离心管中１０　０００　ｒ／ｍｉｎ　表１不同热休克时间大肠杆菌ＤｉＶｏｔ的转化效率　离心１　ｍｉｎ，去除上清，加入１　ｍｌ　０．１　ｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣ１：溶液悬浮细　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ＤｌＩ５ｄ　ｉｎ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　胞，冰浴３０　ｍｉｎ以上，１０　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心１　ｍｉｎ，去上清，再加　ｍｏｍｅｎ￣　入１００　ｌ　０．１　ｍｏＬ／Ｌ　ＣａＣ１　溶液悬浮细胞即可用。　１．２．２酶切与连接。对ｐＢｌｕｅｓｅｒｉｐｔ和一个１　０００　ｂｐ的基因　片段用ＢａｍＨ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉ进行双酶切２　ｈ后，按照ＧｅｎＣｌｅａｎ琼　脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒操作步骤回收酶切后的线状质粒　作者简介杜红旗（１９８１一），男，河南睢县人，硕士研究生，研究方向：发　酵工程。　通讯作者，教授级高工，Ｅ—ｍａｉｌ：ｂｉｏｌｃｙ＠１２６．ｃｏｒｎ。　收稿日期２００９－０４－１０　（下转第１０４２３页）　３７卷２２期　曲静等农杆菌介导紫花苜蓿子叶遗传转化的影响因素研究　细胞会因受到毒害而死亡；Ｖｉｒ区基因的活化直接调控着Ｔ－　ＤＮＡ的转移，试验表明，酚类化合物对Ｖｉｒ区基因的活化具　有重要作用。常用诱导物中ＡＳ（乙酰丁香酮）效果最佳　。　２　０００　ｂＤ　目前，转化体的筛选包括抗生素筛选、除草剂筛选和Ｂ一　１　０００　ｂｏ　７５０　ｂｐ　葡萄糖苷酸酶（ＧＵＳ）染色反应筛选３种方法，其中抗生素筛　５００　ｂｐ　选应用较多　］。公农１号紫花苜蓿子叶卡那霉素筛选的临　２５０　ｂｏ　界浓度为７０　ｍｇ／Ｌ，该试验采用后期选择的方法，先使外植体　１００　ｂｐ　再生然后进行遗传转化，有利于提高转化率。并以２０、３０、５０　ｍｇ／Ｌ卡那霉素为梯度筛选浓度，得到了更多的抗性植株，非　注：Ｍ．ＤＬ２ＯＯＯＤＮＡ分子量标记；１．非转基因植株对照；２．未转化植株；３　转化细胞在无选择培养基中也能生长，并对转化细胞有滋养　５．转基因植株；６．阳性质粒。　Ｎｏｔｅ：Ｍ．ＤＩ２．０００　ＤＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｍａｒｋｅｒ；１．Ｎｏｎ—ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ　作用，从而有利于转化细胞的生长。　ＣＫ；２．Ｕｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｐｌａｎｔ；３—５．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ；６．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　参考文献　ｐｌａｓｍｉｄ．　［１］黄文惠，刘自学．概论苜蓿的分布和发展［Ｍ］／／中国苜蓿．北京：中国　农业出版社，ｌ９９５：２—７．　图３转化植株的ＰＣＲ检测　［２］ＫＨＯＵＤＩ　Ｈ，ＬＡＢＥＲＧＥ　ｓ，ＦＥＲＵＬＬＯ　Ｊ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｆｉｇ．３　ＰＣＲ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｐｌａｎｔｓ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｎ　ｐｅｒｅｎｎｉａｌ　ａｌｆａｌｆａ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏ－　３讨论　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９９，６４：１３５—１４３．　［３］ＡＵＳＴＩＮ—ＰＨＩＬＬＩＰＳ　ｓ，ＺＩＥＧＥＬＨＯＦＦＥＲ　Ｔ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｌｕｅ－ａｄｄｅｄ　以紫花苜蓿子叶为受体材料，通过抗卡那霉素筛选，探　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ａｌｆａｌｆａ［Ｃ］／／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｆｏｒａｇｅ　ｃｒｏｐｓ．　讨了根癌农杆菌菌株类型、菌液浓度、侵染时间等对根癌农　Ｄｏｒｄｒｅｅｈｔ：Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０００：２８５—３０１．　［４］ＤＵＳ　ＳＡＮＴＯＳ　Ｍ　Ｊ，ＷＩＧＤＯＲＯＶ１ＴＺ　Ａ，ＩＴＯＮＯ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｅｔｈａｄｏｌ－　杆菌介导苜蓿遗传转化的影响。农杆菌侵染时间的确定在　ｏｇｙ　ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ａ　ｆｏｏｔ　ａｎｄ　ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ（ＦＭＤＶ）ｐｅｐｔｉｄｅ—ｂａｓｅｄ　ｖａｃ－　苜蓿遗传转化过程中是非常重要的环节，合适的农杆菌侵染　ｃｉｖｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｅ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２０Ｏ２，２０（７／８）：１１４１—１１４７．　［５］郝林，徐听，王尊生．重组蛋白在植物体中的表达及其应用［Ｊ］．植物学　时间，一方面可以减少后继培养中可能造成的污染，另一方　通报，２００４，２１（１）：１０１—１１２．　面可减轻细菌对植物细胞的毒害作用。另外，植物材料的预　［６］马三梅，王永飞，王亚琴．利用转基因植物生产可食疫苗［Ｊ］．生命的化　学，２００４，２４（１）：２２—２４．　培养时间、侵染后植物材料的暗培养、乙酰丁香酮等对转化　［７］王关林，方宏筠．植物基因工程［Ｍ］．２版．北京：科学出版社，２Ｏ０２：７４４，　率也有影响。外植体预培养时间以２～３　ｄ为宜；共培养时间　６０６—６１２．３８８—３９６．　必须长于１６　ｈ，但共培养时间过长，农杆菌会过度生长，植物　（上接第１０４２０页）　ＤＮＡ进入感受态细胞，转化效率很可能就高。　佳的热休克时间３０　Ｓ下，无论是质粒或连接产物Ｏ．２　ｒｎｌ　ＰＣＲ　同时对大肠杆菌ＴＧ１感受态的转化效率也从不同的容　管的转化效率均高于１．５　ｍｌ的离心管２倍以上。　器和热休克时间上做了探讨，但是其差别不明显（试验数据　３讨论　为显示），所以不同的菌株其转化效率和主要影响因素是不　常见的转化方法有电激法、ＭｇＣ１，法和ＤＭＳＯ法、ＬｉＡｃ　同的。　法和ＣａＣ１　法等多种，而ＣａＣ１：法以相对低的成本、操作方便　转化效率的高低直接影响到前后试验的进展和工作效　和相对理想的转化效率受到科研工作者的青睐，但目前转化　率，所以在连接产物连接效率低时，此方法很可能大大提高　的机制尚不清楚，转化的过程中细胞膜经历了复杂的生物物　转化和筛选到阳性克隆的成功率，大大提高工作效率。　理化学变化过程。一般认为通过ＣａＣ１　等化学试剂在低温　参考文献　下与细菌的质膜相互作用使其通透性增加，从而使得细胞接　［１］ＣＯＨＥＮ　Ｓ　Ｎ，ＣＨＡＮＧ　Ａ　Ｃ，ＨＳＵ　Ｅ．Ｎｏｎｃｈｒｏｍａｓｏｍａｌ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　受外源ＤＮＡ的能力大大增强，因此处于“感受态”状态。　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ：ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｎａｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｂｙ　Ｒ—ｆａｃｔｏｒ　ＤＮＡ　［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１９７２，６９（８）：２１１０—２１１８．　试验结果表明，在Ｏ．２　ｍｌ　ＰＣＲ管热休克时间３０　ｓ条件　［２ｊ　ＣＯＨＥＮ　Ｓ　Ｎ，ＣＨＡＮＧ　Ａ　Ｃ，ＢＯＹＥＲ　Ｈ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｙ　下，无论是质粒或连接产物Ｏ．２　ｍｌ　ＰＣＲ管的转化效率均高　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｉｎ　ｖｈｒｏ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｉｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１９７３，７０　（１１）：３２４０—３２４．　于１．５　ｍｌ的离心管２倍以上。思考其原因可能是：①０．２　ｍｌ　［３　Ｊ王立良，王淼，陈连凤，等．冷冻复苏法高效转化大肠杆菌［Ｊ】．生物技　ＰＣＲ管的管壁比１．５　ｍｌ离心管管壁薄；②０．２　ｍｌ　ＰＣＲ管的　术通讯，２００２，１３（３）：１９４—１９５．　［４］令利军，朱艳，王红梅，等．保存时间及温度对大肠杆菌感受态转化效　管头尖，同样体积的转化体系接触热水的面积较１．５　的离　率的影响［Ｊ］．生物技术通讯，２ＯＯ４，１５（１）：５１—５２．　心管大。这２种离心管的差别均可导致Ｏ．２　ｍｌ　ＰＣＲ管升温、　［５］李路冶，易建华，李敏．大肠杆菌最佳感受态细胞制备的探讨［Ｊ］．生命　科学研究，１９９８，２（３）：１９４—１９８．　降温的速率均比１．５　ｍｌ离心管盼陕。所以在其他条件相同，　［６］张卫林，赵晶，李芬．冰浴时间对氯化钙转化法转化效率的影响［Ｊ］．安　在最佳转化温度下，传热速率快的转化体系更加有利于外源　徽农业科学，２０Ｏ７，３５（３０）：９５７．