新生大鼠心肌细胞原代培养方法

世界中西医结合杂志２０１２年第７卷第４期ｗ。ｒｉｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ。ｆ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２０１２，Ｖ。１．７，Ｎ。．４　‘２９３・　・实验研究・　新生大鼠心肌细胞原代培养方法　张滕　郭利平　【摘要】　目的探讨乳鼠心肌细胞的原代培养方法，更好地获取高存活率、高搏动率及高纯度　的心肌细胞，以建立良好的原代心肌细胞研究模型。方法无菌状态下取出生３　ｄ以内Ｗｉｓｔａｒ乳鼠　心室肌，以混合消化酶（０．０６％胰蛋白酶和０．１％１Ｉ型胶原酶均量混合液）反复进行短时间多次消化，　用差速贴壁法纯化心肌细胞，并加入５一溴脱氧尿嘧啶抑制非心肌细胞分裂增殖，２　ｄ后首次换液，以　后隔日换液。结果心肌细胞２４　ｈ左右已基本贴壁，并可见单个细胞搏动，２～６　ｄ形成单层心肌细　该方法是一种较为理想的乳鼠原代心肌细胞培养方法，值得进一步推广。　胞和其细胞簇的同步搏动，经培养所获细胞搏动良好，存活率高，免疫组化鉴定显示培养的心肌细胞　纯度９５％以上。结论【关键词】心肌细胞；原代培养；乳鼠　【中图分类号】Ｑ８１３．１　１　【文献标识码】Ａ【文章编号１　１６７３—６６１３（２０１２）０４—０２９３—０３　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｎｅｗｌｙ．．ｂｏｒｎ　Ｒａｔｓ　ＺＨＡＮＧ　Ｔｅｎｇ　，ＧＵＯ　Ｌｉ—ｐｉｎｇ　（１．２００９　Ｍａｓｔｅｒ—ｄｅｇｒｅｅ　Ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｏｆ　Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００１９３：２．　Ｔｉａｎｉｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｉａｎｉｉｎ　３００１９３）　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅｓ　ｆ０ｒ　ｔｈｅ　ｓｕｃｋｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ＳＯ　ａｓ　ｔｏ　ｂｅｔｔｅｒ　ｏｂｔａｉｎ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｌｉｖａｂｉｌｉｔｙ，ｈｉｇｈ　ｐｕｌｓａｔｉｎｇ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｅｓｔａｂ—　ｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ—ｃｕｈｕｒｅｄ　ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｇｅｒｍ—ｆｒｅｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．　ｔｈｅ　ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｍｕｓｃｌｅ　ｗａｓ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　３　ｄ—ｂｏｒｎ　Ｗｉｓｔａｒ　ｓｕｃｋｉｎｇ　ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ　ｍｉｘｅｄ　ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ＳＯ　１ｕｔｉｏｎ（ｔｈｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｙｐｓｉｒｎ　０．０６％ａｎｄ　ＩＩ—ｔｙｐｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　０．１％，ｅｑｕａｌ　ｄｏｓｅ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｓｈｏｒｔ　ｔｉｍｅ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｗａｓ　ａｄｏｐｔｅｄ　ｔｏ　ｐｕｒｉｆｙ　ｔｈｅ　ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅｓ．５一ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉ—　ｄｉｎｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｏｎ—ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅｓ．Ｉｎ　２　ｄａｙｓ．ｔｈｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｒｅ—　ｐｌａｃｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｉｔ　ｗａｓ　ｒｅｐｌａｃｅｄ　ｏｎｃｅ　ｅｖｅｒｙ　ｔｗｏ　ｄａｙｓ　ｓｉｎｃｅ　ｔｈｅｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｉｎ　ａｂｏｕｔ　２４　ｈ，ｔｈｅ　ｃａｒｄ—　ｉｏｃｙｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｂａｓｉｃａｌｌｙ．Ｔｈｅ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ　ｗａｓ　ｐｕｌｓａｔｅｄ　ｖｉｓｉｂｌｙ．Ｉｎ　２　ｔｏ　６　ｄ．ｔｈｅ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｆｏｒｍｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｗａｓ　ｐｕｌｓａｔｅｄ　ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｌｙ．Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ，ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｗｅｒｅ　ｐｕｌｓａ—　ｔｅｄ　ｗｅｌ１．Ｔｈｅ　ｌｉｖａｂｉｌｉｔｙ　ｗａｓ　ｈｉｇｈ．Ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅａｔｉｏｎ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｕｌ—　ｔｕｒｅｄ　ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅｓ　ｗａｓ　ｏｖｅｒ　９５％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃａｒｄ—　ｉｏｃｙｔｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｕｃｋｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｉｔ　ｄｅｓｅｒｖｅｓ　ｔｏ　ｂｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｄ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅｓ；Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｓｕｃｋｉｎｇ　Ｍｉｃｅ　原代心肌细胞培养技术被广泛应用于心血管　疾病的研究之中，具有操作简便、经济、可重复性等　拘。由天津市山川红实验动物科技有限公司提供，　动物合格证号：０００４０３６。　优点，同时排除了神经、体液等因素的干扰，并可从　细胞分子水平阐明机制问题，但其较低的再生能力　限制了实验模型的理想建立。本文阐述了较为理　想的实验方法，现报道如下。　材料与方法　一２．主要试剂和仪器：胰蛋白酶（Ｓｉｇｍａ），１Ｉ型胶　原酶（Ｇｉｂｃｏ），ＤＭＥＭ—Ｆ１２（Ｈｙｃｌｏｎｅ），胎牛血清　（Ｂｉｏｉｎｄ），５一溴脱氧尿嘧啶（Ｓｉｇｍａ），　一横纹肌肌　动蛋白单克隆抗体（　—ｓａｒｃｏｍｅｒｉ　ｃａｃｔｉｎ，ｏ【一ＳＡ）及　链霉素亲和素一生物素一过氧化物酶复合物（Ｓｔｒｅｐ—　ｔＡｖｉｄｉｎ—Ｂｉｏｔｉｎ　ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ，ＳＡＢＣ）免疫组化　、实验材料　试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），恒温二氧　化碳培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ），倒置相差光学显微镜（Ｌｅｉ．　ｅａ），新颖立式小容量恒温摇床（上海世平实验设备　有限公司），高速冷冻离心机。　二、实验方法　１．实验动物：３　ｄ内的Ｗｉｓｔａｒ新生大鼠，雌雄不　基金项目：国家自然基金资助项目（Ｎｏ．８１０７２９６５）　作者单位：１．天津中医药大学２００９级硕士研究生，天津３００１９３；２．天　津中医药大学，天津３００１９３　通讯作者：张滕，Ｅｍａｉｌ：ａａａ．ｚｈａｎｇｔｅｎｇ１２３＠１６３．ｃｏｎ］　１．心肌细胞的原代培养：取１～３　ｄ龄Ｗｉｓｔａｒ大　・２９４’　世界中西医结合杂志２０１２年第７卷第４期ｗ。ｒｉｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ。ｆ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｔｒａｄｉｔｉ。ｎａｌ　ａｎｄ　ｗｅｓｔｅｍ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２０１２ｖ。１．７．Ｎ。．４　鼠，于含７５％酒精的无菌小烧杯中浸泡５～６　Ｓ后迅　速取出置于无菌培养皿中，无菌开胸，暴露心脏，于　心脏收缩期剪下心脏，放于预冷的盛有ＰＢＳ缓冲液　和少量１％双抗的培养皿中，清洗３次，去除残留血　液，第二次清洗时去掉结缔组织、心房组织及部分　血管。３次清洗后，将其转移至锥形瓶瓶口中，将心　室肌剪为１　ｍｍ。碎块，加入０．１％胶原酶和０．０６％　胰蛋白酶的混合酶５　ｍＬ，新颖立式小容量恒温摇床　３７℃，转速１１０　ｒ・ｍｉｎ～，震荡５　ｍｉｎ，吸取第一次消　化后的上清液，弃去，因其含有残留血细胞和部分　坏死心肌细胞碎片等，于第二次消化时收集上清　液，２００目细胞筛过滤至预冷的盛有５　ｍＬ完全培养　基的５０　ｍＬ离心管里，反复消化４～５次，至组织消　化成半透明状时终止继续消化，１０００　ｒ・ｍｉｎ～，１０　ｍｉｎ离心后倒掉上清液，加入适量完全培养基小心　轻柔重悬细胞沉淀，将混匀的细胞悬液转入７５　ｃｍ　培养瓶中，放入恒温二氧化碳培养箱内，差速培养　１．５　ｈ后取出，将富含心肌细胞的细胞悬液倒入加　样槽，并加终浓度为０．１　ｍｍｏｌ・Ｌ　的５一溴脱氧尿　嘧啶，以抑制非心肌细胞的生长，根据实验目的，轻　柔吹打均匀后种板或加入培养瓶培养，２　ｄ后第一　次换液，以后隔Ｅｔ换液。本次实验取１　ｍＬ加入１２　孔板内，板内含有预先用多聚赖氨酸包被的圆形盖　玻片，用于免疫组化纯度鉴定。　２．心肌细胞的形态学观察　３．心肌细胞存活率检测：取适量差速贴壁后的　细胞悬液与０．４％台盼蓝１：１混匀后滴于细胞计数　板上，倒置相差光学显微镜下观察并计数，着色者　为死细胞，反之为活细胞。计算细胞存活率。　４．心肌细胞纯度鉴定：原代培养３　ｄ后，无菌条　件下取出经多聚赖氨酸包被的细胞爬片，４％多聚甲　醛固定３０　ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗２次，用Ｏｔ—ＳＡ作免疫组　化进行纯度鉴定。　一ＳＡ仅在心脏中的心肌细胞　呈阳性表达，为棕黄色，位于胞浆，而在非心肌细胞　中表达阴性，故可将其作为心肌细胞纯度鉴定的　指标。　结　果　１．倒置相差显微镜进行细胞形态学观察：刚分　离的心肌细胞呈球形，折光性好，培养４～６　ｈ后呈　圆形，后变为梭形，１２　ｈ左右已有多数细胞贴壁，伸　出伪足，变成不规则三角形或多边形，２４　ｈ细胞几　乎完全贴壁，有少数贴壁的单个细胞出现自发性搏　动，４８　ｈ细胞伸出伪足相互交织成网，２～６　ｄ逐渐　．形成细胞簇或单层细胞，且呈现同步性搏动，搏动　频率多在８０～１５０次・ｍｉｎ～。结果见图１、图２。　图１培养４８　ｈ的心肌细胞　图２功能性细胞簇　（倒置相差显微镜×２００）　（倒置相差显微镜×４００）　２．心肌细胞存活率检测结果：细胞存活率（％）　＝活细胞总数／（活细胞总数＋死细胞总数）Ｘ　１００％，用细胞计数板计数，测得存活率为９５．８％。　３．心肌细胞纯度结果：随机选取５个视野分别　计数细胞总数和阳性细胞数。经免疫组化鉴定，阳　性率达９５％以上，提示心肌细胞纯度较理想。结果　见图３、图４。　图３　０ｌ—ＳＡ阳性心肌细胞　图４　Ｏ．／一ＳＡ阳性心肌细胞　（免疫细胞化学染色ｘ２００）　（免疫细胞化学染色Ｘ４００）　讨　论　心脏由心肌细胞和非心肌细胞（如成纤维细胞　和内皮细胞等）组成，心肌细胞增殖能力低，而非心　肌细胞易于贴壁且有较强的分裂增殖能力，很容易　长成优势细胞，故如何在体外获取高纯度的心肌细　胞培养模型对实验研究的科学性和实验结果的可　靠性具有重要意义。笔者认为培养要点有以下几　方面：（１）无菌操作：无菌取心脏时可于剑突上一肋　处入剪，避免剪破消化道，减少污染机会，此外用于　细胞培养的手术器械、培养皿、培养液、血清、缓冲　液、组织材料来源等，应严格按无菌试验要求准备，　培养过程中具体操作流程亦应严格遵循实验无菌　原则。（２）消化酶浓度和消化时间：笔者认为此为　原代培养关键，胰蛋白酶可使细胞问的蛋白质水　解，细胞分散，作用较强，而Ⅱ型胶原酶对胶原的消　化作用很强，仅对细胞间质有消化作用，作用缓和。　本实验选择了较低浓度的胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶　均量混合后少量多次消化，使得心肌细胞受损程度　减低，存活率和纯度提高，消化　（下转第３１９页）　世界中西医结合杂志２０１２年第７卷第４期ｗ。ｒｉｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　０ｆ　Ｉｎｔｅ　ａｔｅｄ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２０１２，Ｖ０１．７，Ｎ。．４　‘３１９・　经兴奋性，增加血红蛋白含量，抗缺氧及自由基氧　化，增强机体抗疲劳系统的功能，提高运动能力。　补阳还五汤加味能起到以补气为主，兼以活血通络　的特点，同时又应用针刺疗法，发挥其直接疏通经　络，调整经络之气血阴阳的作用。二者配合使用，　在功用上既相互促进，又可弥补对方之不足，标本　同治，相得益彰，有效地降低了肌肉的痉挛。这对　脑卒中后痉挛性偏瘫的患者来说具有特别的意义。　因为疼痛的缓解，肌肉痉挛的减轻，抗疲劳能力的　的作用，对治疗脑卒中后半身不遂、关节疼痛，提高　运动耐力有着很好的疗效。　针灸治疗作用之一在于调和阴阳，针灸施治的　总则之一在于补虚泻实。《灵枢・根结》篇说：“用　针之要，在于知调阴与阳，调阴与阳，精气乃光，合　提高，使患者可以有耐力应付其他辅助的运动治疗　和日常生活活动，从而提高生活质量。　参考文献　形与气，使神内藏。”《素问・至真要大论》也说：“谨　察阴阳所在而调之，以平为期。”明确指出了针灸治　病的关键就在于调节阴阳的偏盛偏衰，使机体转归　于“阴平阳秘”，恢复其正常的生理功能，从而达到　治愈疾病的日的。可见调和阴阳是针灸治病的最　终目的。脑卒中后肢体痉挛表现为阴急阳缓，根据　［１］Ｅｌｏｖｉｃ　Ｅ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｆ　ｏｓｐａｓｔｉｃ　ｈｙｐｅｒｔｏ—　ｎｉａ『Ｊ１．Ｐｈｙｓ　Ｍｅｄ　Ｒｅｈａｂｉｌ　Ｃｌｉｎ　Ｎ　Ａｎｔ，２００１，１２（４）：７９３—８１６．　［２］国家中医药管理局脑病急症协作组．中风病诊断与疗效评定标　准（试行）［Ｊ］．北京中医药大学学报，１９９６，１９（１）：５５—５６．　［３］肖淑杰，李惠兰，陈之罡，等．拮抗肌取穴针刺治疗偏瘫病人患肢　痉挛２（】例的临床观察［Ｊ］．针灸临床杂志，１９９６，１２（１１）：９—１０．　［４］中华人民共和国卫生部医政司．中国康复医学诊疗规范［Ｍ］．北　京：华夏出版社，１９９８：１５．　中医学基本理论，拘急痉挛属实，弛缓属虚。故其　治疗宜泻实补虚，即泻阴补阳，具体地说即采用毫　针刺，拘急侧穴位用泻法，弛缓侧穴位用补法，以调　和阴阳，使阴阳相济，恢复平衡。　因此，在本研究中，笔者采用了中药、针刺内外　兼用，一方面发挥了中药内服，调整脏腑阴阳气血　［５］乔玉成．关于中医药抗运动性疲劳的立法思考［Ｊ］．北京体育大　学学报，２０００，２３（４）：４９０—４９２．　（收稿日期：２０１２—０２—２０）　（上接第２９４页）　会影响心肌细胞的形态结构和生理功能　Ｊ，５一溴　脱氧尿苷的作用是替代胸腺嘧啶核苷酸掺人ＤＮＡ　中，从而阻止生长活跃的非心肌细胞的增殖，一般　于培养前３　ｄ在培养基中加入终浓度为０．１　ｍｍｏｌ・　Ｌ　的Ｂｒｄｕ即可。　温度为３７℃，此温度下酶活性最强。每次消化时间　不宜过久，以便减轻胰酶对单细胞的破坏作用，吹　打细胞时动作尽量轻柔，避免气泡产生。（３）培养　液的选择：培养液可用ＥＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｍ１９９、　ＭＣＨＢ１０７液、ＤＭＥＭ／Ｆ１２液，其中以ＤＭＥＭ／Ｆ１２液　心肌细胞培养在心血管研究领域中有着广阔　最佳，培养液ｐＨ值一般为７．０～７．２　。（４）差速　时间的选择：非心肌细胞如成纤维细胞，往往很早　就附着于培养瓶表面，根据这一特点，可以将非心　肌细胞和心肌细胞分离开来，不同的差速贴壁时间　对心肌细胞培养有显著差异，其中差速贴壁６０、９０　ｍｉｎ效果较好，不仅可以获得纯度高的心肌细胞，而　且可以保证得到较高心肌细胞的数量　。本实验　选择９０　ｍｉｎ为差速培养时间。（５）换液时间：为避　免心肌细胞随换液而被丢弃，应在４８　ｈ后换液，这　的应用前景，通过本实验可制得较为理想的体外细　胞实验模型。　参考文献　［１］杨瑞丰，潘伟．心肌细胞培养进展［Ｊ］．中国心血管病研究杂志，　２００５，３（８）：６３４—６３６．　［２］邵华，金秀东，梁军，等．不同差速贴壁时间对心肌细胞培养的影　响实验性研究［Ｊ］．牡丹江医学院学报，２００８，２９（１）：３—４．　［３］王涛，余志斌，谢满红，等．新生大鼠心肌细胞培养技巧［Ｊ］．第四　军医大学学报，２００３，２４（２）：Ｆ００２．　１　４　ｊ　Ｍｉｒａｇｏｌｉ　Ｍ，Ｇａｕｄｅｓｉｕｓ　Ｇ，Ｒｏｈｒ　Ｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｔｏｎｉｃ　ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｒｄｉａｃ　样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且５一　溴脱氧尿嘧啶作用时间越长，对成纤维细胞的抑制　作用更确实　。（６）５一溴脱氧尿嘧啶的使用：细胞　培养中的非心肌细胞主要是成纤维细胞，其分泌物　ｉｍｐｕｌｓｅ　ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ［Ｊ］．Ｃｉｒａｃ　Ｒｅｓ，２００６，９８（６）：　８０１—８１０．　（收稿日期：２０１２—０２—０５）