熊果酸对人胃癌细胞株MGC-803的抑制作用及其机制

维普资讯 http://www.cqvip.com 山东医药２００７年第４７卷第２７期　熊果酸对人胃癌细胞株ＭＧＣ一８０３的　抑制作用及其机制　王琼　，陈建军　，向谨逸　（１湖北省新华医院，湖北武汉４３００１５；２崇阳县人民医院；３华中科技大学同济医学院）　［摘要］　目的０２１　表达。结果观察熊果酸（ＵＡ）对胃癌细胞株ＭＧＣ．８０３的抑制增殖作用。方法培养胃癌细胞株ＭＧＣ．　８０３，以ＭＴｒ比色法及生长曲线测定ＵＡ对ＭＧＣ－８０３抑制增殖的作用。免疫印记法测定ｐ－ＥＲＫ　、Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１、　ＭＴＴ实验及生长曲线均显示ＵＡ明显抑制ＭＧＣ－８０３细胞增殖，免疫印记法显示ＵＡ抑制Ｐ．　表达。结论熊果酸可以抑制ＭＧＣ－８０３增殖，机制与影响ｐ－ＥＲＫ　及下　表达有关。　［文献标识码］　Ａ　［文章编号］　１００２－２６６Ｘ（２００７）２７－００３０－０２　ＥＲＫ。　Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１表达，同时上调０２１　游Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１、０２１　［关键词］　熊果酸；胃肿瘤；细胞外信号调节激酶；增殖　［中图分类号］Ｒ７３５．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ＭＧＣ－８０３　ｅｅｌｌｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｉｔ’Ｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ＷＡＮＧ　ＱｉｏｎｇＩ，ＣＨＥＮ　Ｊｉａｎ．】ｕｎ。ｘＩＡＮＧ　Ｊｉｎ・ｙｉ　（１　Ｘｉｎｈｕａ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ肌６　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｗｕｈａｎ　４３００１５，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ＭＧＣ．　８０３　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ．［Ｍｅｔｈｏｄｓ］１＇ｌｌｅ　ｅｆｅｃｔ　ｆ　ｏＵｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｆ　ｏＭＧＣ－８０３　ｃｅｌｌｓ　、ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｆ　ｏｐ－ＥＲＫｌ／２，Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１，０２１　“　Ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．［Ｒｅｓｕｌｔｓ］Ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｃｏｕｌｄ　ｄｅｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＧＣ－８０３　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐ－ＥＲＫｌ／２　ａｎｄ　Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１　ｗｅｒｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｉｌｅ　２１０　“　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｗａｓ　ｅｌｅｖａｔｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｃａｎ　ｄｅｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＧＣ－８０３　ｃｅｌｌ　ｈｎｅ　ｗｉｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ＥＲＫ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｆｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ；ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｉｇｎａｌ・ｒｃｇｕｌａｔｅｄ　ｋｉｎａｓｅ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　熊果酸（ｕＡ）又名乌索酸、乌苏酸，属于三萜类　化合物，广泛存在于熊果、白花蛇舌草、女贞子、乌梅　等天然植物和草药中，具有抗炎、护肝、降血脂等多　种生物学活性，近年来其抗肿瘤作用日益受到重视。　研究发现ＵＡ可抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导其凋　亡－】　Ｊ，但作用机制尚不十分清楚。２００６年９月～　标记山羊抗小鼠第二抗体、碱性磷酸酶显色试剂盒　购于北京中山生物公司。　１．２实验方法　１．２．１细胞培养ＭＧＣ一８０３细胞在含１０％胎牛血　清及青、链霉素各１　Ｘ　１０　Ｕ／Ｌ的ＲＰＭＩ　１６４０培养基　中贴壁生长，于３７℃、５％ＣＯ　培养箱中传代培养，　取３～６代细胞用于实验。按照培养基中试剂不同，　将培养的ＭＧＣ－８０３细胞随机分为４组：对照组（培　２００７年３月，我们使用不同浓度熊果酸作用于胃癌　ＭＧＣ一８０３细胞株，检测细胞增殖的各项指标，研究Ｐ—　ＥＲＫ　、Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１及ｐ２１础　ｐ】的表达情况，旨在为其　用于抗肿瘤治疗方面奠定试验基础。　１材料与方法　养基）；１０、２０、４０￣ｍｏｌ／Ｌ　ｕＡ组。收集对数生长期　的细胞，以５×１０　个细胞／ｍｌ接种于培养瓶，２４　ｈ换　液１次。当细胞达到亚融合状态，无血清培养基培　养１２　ｈ。按分组要求加人不同浓度熊果酸、培养基，　１．１　材料　胃癌细胞株ＭＧＣ一８０３由华中科技大学　同济医学院实验中心提供。熊果酸购自武汉天源生　物技术公司；ＲＰＭＩ　１６４０培养基、胎牛血清均购自美　国Ｓｉｇｍａ公司；标准蛋白及增强化学发光剂ＥＣＬ购　于Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ公司，小鼠抗大鼠ｐ－ＥＲＫ　、　Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１及ｐ２１　３０　使各瓶终体积均为２　ｍｌ。１２　ｈ后收集细胞，进行下　列测定。　１．２．２　Ｍ１Ｔｒ比色消化处于对数生长期的细胞以　５×１０　个细胞／ｍｌ接种于９６孔板，在３７℃、５％　ＣＯ　、饱和湿度条件下培养。当细胞达到亚融合状态　单克隆抗体抗体、碱性磷酸酶　维普资讯 http://www.cqvip.com 山东医药２００７年第４７卷第２７期　时，每孔加入２００　ｌ无血清培养基，１２　ｈ后弃培养　基。加入不同量的熊果酸及培养基，各孔终体积均　为２００　ｌ。２　ｄ后弃培养基，每孔加ＭＴＴ溶液（５　ｍｇ／　ｍ１）２０　ｌ。孵育４　ｈ，每孔加入１５０　ｌ　ＤＭＳＯ，振荡　响见表１。　表１各组ｐ－ＥＲＫ１／２、Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１、ｐ２１　表达水平比较（ｎ＝８，ｉ±Ｓ）　１０　ｍｉｎ，用酶联免疫检测仪读取每孔ＯＤ值（测量波　长６２０　ｎｍ，参考波长４９０　ｎｍ）。生长抑制率ＩＲ（％）　＝１一Ｂ／Ａ×１００％（Ａ、Ｂ分别为对照组和实验组的　光密度值）。　１．２．３生长曲线测定取对数生长期细胞２×１０　置于２５　ｍｌ培养瓶中，培养２４　ｈ后，去培养液，加入　以上分组的培养液和熊果酸，连续培养６　ｄ，每天取６　瓶细胞，以台盼蓝法计算活细胞数，绘制生长曲线。　１．２．４免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ）检测ｐ　ＥＲＫ　、　Ｃｙｅｌｉｎ　Ｄ１、ｐ２１　蛋白表达取５×１０　个各组干　预后的细胞，加入５倍体积的细胞裂解液孵育２０　ａｒｉｎ。取４０　ｇ总蛋白加入上样缓冲液煮沸变性，经　ＳＤＳ／ＰＡＧＥ凝胶电泳，然后电转移至ＰＶＤＦ膜，封闭　后与１：１　０００稀释的一抗４℃孵育过夜，再与１：　１０　０００稀释的二抗室温孵育２　ｈ，与增强化学发光试　剂温浴５　ｍｉｎ后曝光、显影和定影，对结果进行吸光　度扫描分析，并与对照组结果进行对比。　１．３统计学方法所有数据均采用ｘ±ｓ表示，采用　ＳＰＳＳ　１０．０软件包进行方差分析，以Ｐ≤０．０５为有统　计学差异。　２结果　２．１　熊果酸对ＭＧＣ一８０３细胞增殖的抑制作用ＭＴＩ＂　比色法检测结果显示，对照组及ｌ０、２０、４０　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ　ＵＡ　组ＩＲ分别为０、１２．１６％±３．２６％、３４．３６％±６．２６％、　５３．８０％－４－９．２２％，后三组均明显高于对照组（Ｐ＜　０．０５、＜０．０１、＜０．０１、ｎ＝８），且随着浓度升高，ＩＲ明　显上升。　２．２熊果酸对ＭＧＣ－８０３细胞生长曲线的影响见　图１。　２　×　型　景　＼．／　０　１　２　３　４　５　６（ｄ）　图１　熊果酸对ＭＧＣ－８０３细胞生长曲线的影响（ｎ＝８）　２．３熊果酸对ｐ　ＥＲＫ　Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１、ｐ２ｌ　ｉ　表达影　注：与对照组比较，　Ｐ＜０．０５，　Ｐ＜０．０１　３讨论　细胞外调节信号激酶（ＥＲＫ）是ＭＡＰＫ家族的一　个亚族，家族中研究最多，也最重要的是ＥＲＫ　可　被多种生长因子、细胞因子激活，参与调节细胞的增　殖与分化。ＥＲＫ活化后通过转录调节引起多种基因　包括细胞周期素Ｄ１（Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１）等基因的相继激活　导致细胞恶性转化，在细胞生长、发育、分裂、死亡及　恶性转化等过程中起重要作用Ｈ　。Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１属细　胞周期抑制因子，是Ｇ　／Ｓ期转化的重要蛋白，研究　发现其在肿瘤细胞中表达增高，并与肿瘤细胞异常　增殖、侵袭和预后有关。ｐ２１　是最早发现和克隆　的家族成员之一，其羧基端与ＰＣＮＡ结合，使之不能　与ＤＮＡ聚合酶形成复合物，影响ＤＮＡ复制，阻止细　胞周期进程；其氨基端与Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ／Ｅ结合，从而使　ＲＢ蛋白不能磷酸化，使细胞周期停滞于Ｇ　期。有　研究表明ｐ２１　蛋白与细胞衰老、分化及肿瘤发　生、发展有关。　本研究结果显示，熊果酸浓度依赖性抑制ＭＧＣ一　８０３细胞增殖率。本文结果亦提示，熊果酸抑制　ＭＧＣ一８０３细胞生长的作用可能与影响ＥＲＫ信号通　路及其下游信号分子如Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１、ｐ２１　有关。　但尚不能排除熊果酸对其他促瘤细胞生长的信号通　路的干预。　［参考文献］　［１］Ｈｏｌｌｏｓｖ　Ｆ，Ｌｄｅｉ　Ｍ，Ｃｓｏｒｂａ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ－３　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　［Ｊ］．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００１，２１（５）：３４８５－３４９１．　［２］Ｂａｅｋ　ＪＨ，Ｌｅｅ　ＹＳ，Ｋａｎｇ　ＣＭ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃａ“ｒｅｌｅａｓｅ　ｍｅｄｉ．　ａｔｅｓ　ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｅｍｉｃ　ＨＬ＿６０　ｃｅｌｌｓ　［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，１９９７，７３（５）：７２５－７２８．　［３］Ｈｓｕ　ＹＬ，Ｋｕｏ　ＰＬ，Ｌｉｎ　ＣＣ．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ｃｅｌｌｃｙｃｌｅ　ｄｙｓｒｅｇ－　ｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｎｏｎ－　ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　Ａ５４９　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ，２００４，７５（１９）：　２３０３．２３１６．　［４］褚传莲，李延青，李文婕，等．ＥＲＫ１、ＥＲＫ２在胃腺癌中的表达及　临床意义［Ｊ］．山东医药，２００２，４２（２２）：５－７．　（收稿日期：２００７－０５．２４）　３ｌ