基于蛋白L染色方法的流式细胞术检测嵌合抗原受体的表达

临床检验杂志２０１８年４月第３６卷第４期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｌａｂ　Ｓｃｉ，Ａｐｔ．２０１８，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．４　·２４１·　·ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０１８．０４．０１　临床检验技术研究·　基于蛋白Ｌ染色方法的流式细胞术检测嵌合抗原受体　的表达　邓海峰　，韩为东　，蒋敬庭。（１．苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心，江苏省肿瘤免疫治疗工程技术研究中　心，苏州大学细胞治疗研究院，江苏常州２１３００３；２．解放军总医院分子免疫学研究室，北京１００８５３）　摘要：目的探讨以蛋白Ｌ（ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ）为基础的流式细胞染色方法用于检测患者Ｔ细胞表面嵌合抗原受体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　单采２例ＣＤ１９阳性淋巴瘤患者外周血单个核细胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）表达的技术可行性。方法ｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣｓ），磁珠分选法获得Ｔ细胞，加入靶向ＣＤ１９、ＣＤ２２的ＣＡＲ逆转录病毒，转染、诱导培养成ＣＡＲ·Ｔ细胞。通过生物　素化蛋白Ｌ（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ）一亲合素（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ—ＰＥ）系统对ＣＡＲ—Ｔ细胞表面的单链抗体片段（ｓｉｎｇｌｅ—ｃｈａｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇ—　ｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）进行标记，用流式细胞术检测活化培养的Ｔ细胞中ＣＤ１９一ＣＡＲ、ＣＤ２２－ＣＡＲ表达阳性Ｔ细胞的比例，以常规Ａｎｔｉ—ＩｇＧ　染色的流式细胞检测方法作为对照组，进行结果对比。结果ｓｃＦｖ—ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ—ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ—ＰＥ－流式细胞染色方法能　够检测到ＣＡＲ—Ｔ细胞表面ＣＡＲ表达。２例患者蛋白Ｌ实验组和Ａｎｔｉ—ＩｇＧ对照组ＣＤ１９一ＣＡＲ—Ｔ细胞比例分别为７１．６％ｖｓ　６４．２％和４９．３％ｖｓ　４３．８％：ＣＤ２２．ＣＡＲ．Ｔ细胞比例分别为５３．１％ｖｓ　４６．３％和５６．５％ｖｓ　６４．０％，测定结果相似。结论　以蛋　白Ｌ为基础的染色方法可以作为流式细胞术检测ＣＡＲ—Ｔ细胞的常规染色方法。　关键词：嵌合抗原受体Ｔ细胞；蛋白Ｌ；流式细胞术　中图分类号：Ｒ４４６．６　文献标志码：Ａ　Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ＤＥＮＧ　Ｈａｉｆｅｎｇ　，ＨＡＮ　Ｗｅｉｄｏｎｇ　，ＪＩＡＮＧ　Ｊｉｎｇｔｉｎｇ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅ　Ｔｈｉｒｄ　Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｏ—　ｃｈｏｗ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ　２１３００３，Ｊｉａｎｇｓｕ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｐ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，　Ｂｅｉｎｇ　１００８５３，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｖｅｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ　ｉｎ　ｌｆｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｘ—　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｍｅｉｒｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｐｅｉｒｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣｓ）ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　２　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＣＤ１９　ｌｙｍｐｈｏｍａ　ｂｙ　ｈｅｍａｐｈｅｒｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｐｕｒｉｉｆｅｄ　ｂｙ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄ　ｓｅ—　ｌｅｃｔｉｏｎ．ＣＡＲ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＣＤ１９　ａｎｄ　ＣＤ２２　ｉｎｔｏ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｅ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ—ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ（ＣＡＲ—Ｔ　ｃｅｌｌｓ）．Ｔｈｅ　ｓｉｎｇｌｅ—ｃｈａｉｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ＣＡＲ—Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｂｙ　ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ｐｒｏ—　ｔｅｉｎ　Ｌ—ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ—ＰＥ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＣＤ１９一ＣＡＲ　ａｎｄ　ＣＤ２２一ＣＡＲ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｏｓｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｍｅｔｈｏｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ａｎｔｉ—ＩｇＧ　ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅ—　ｓｕｉｔｓ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＡＲ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ＣＡＲ—Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ—ｃｈａｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）一ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ—ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ—ＰＥ．Ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ＣＤ１９一ＣＡＲ－Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　２　ｐａ—　ｔｉｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　７１．６％ｖｓ　６４．２％ａｎｄ　４９．３％ｖｓ　４３．８％ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ａｎｔｉ—ＩｇＧ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｅｒ－　ｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ＣＤ２２一ＣＡＲ－Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　５３．１％ｖｓ　４６．３％ａｎｄ　５６．５％ｖｓ　６４．０％．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｏｔｈ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｓｉｍｉｌａｒ．Ｃｏｎｃｌｕ－　ｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａ　ｒｏｕｔｉｎｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＡＲ—　Ｔ　ｃｅｌｌｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ—ｍｏｄｉｉｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｆｌｓ；ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ；ｆｌｏｗ　ｅｙｔｏｍｅｔｒｙ　嵌合抗原受体Ｔ细胞（ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ—　ｍｏｄｉｉｆｅｄ　Ｔ　ｃｅｉｌｓ，ＣＡＲ．Ｔ）是经过基因工程修饰后的Ｔ　细胞，在细胞膜上表达特异性的单链抗体片段（ｓｉｎ—　ｇｌｅ—ｃｈａｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ），并以此识别靶抗　活化信号至细胞内，Ｔ细胞随后活化、增殖并表现出　特异的细胞毒性，从而杀伤靶细胞　。ＣＡＲ．Ｔ治疗　技术在血液系统肿瘤的治疗中已取得突破　，在　实体肿瘤的研究中也展现出广阔的应用前景…。　原，通过Ｔ细胞受体‘链、共刺激分子等胞内区传递　蛋白Ｌ（ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ）是从消化链球菌中分离出来　基金项目：国家科技支撑计划（２０１５ＢＡＩ１２Ｂ１２）；国家自然科学基金（３１５７０８７７、３１５７０９０８）；海外及港澳学者合作研究基金（３１７２００１）；　江苏省肿瘤免疫治疗工程技术研究中心（ＢＭ２０１４４０４）。　作者简介：邓海峰，１９７２年生，男，硕士，副主任技师，主要从事肿瘤免疫学研究。　通信作者：蒋敬庭，教授，博士，博士研究生导师，Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｊｉｎｇｔｉｎｇ＠ｓｕｄａ．ｅｄｕ．ｃｎ。　·２４２·　临床检验杂志２０１８年４月第３６卷第４期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｌａｂ　Ｓｃｉ，Ａｐｒ．２０１８，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．４　的一种抗体结合蛋白，能与ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ和ＩｇＤ　等抗体的ｋａｐｐａ轻链相结合，且不影响抗原结合位　点　Ｊ。嵌合抗原受体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　ＣＡＲ）的ｓｃＦｖ是由抗体重链可变区（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ，ＶＨ）和轻链可变区（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ，ＶＬ）通过短肽连接而成，理论上ＶＬ有蛋　白Ｌ结合的位点。本研究旨在探讨基于蛋白Ｌ染　色方法的流式细胞术检测ＣＡＲ表达的可行性。　１材料与方法　１．１研究对象血液样本取自２０１７年２月至８月　在苏州大学附属第三医院参加“嵌合抗原受体Ｔ细　胞治疗化疗抵抗的或难治性ＣＤ１９阳性淋巴瘤”临　床试验的２例患者，其中男１例，年龄６６岁，弥漫大　Ｂ细胞淋巴瘤，Ⅳ期Ｂ组；女１例，年龄４５岁，弥漫　大Ｂ细胞淋巴瘤，Ⅲ期Ｂ组，免疫组化染色均ＣＤ１９　阳性。此临床试验经过医院伦理委员会批准，患者　知情同意。　１．２主要试剂及仪器人全血单个核细胞分离液　（天津灏洋公司），ＬＳ分离柱（德国Ｍｉｌｔｅｎｙｉ公司），　ＲＰＭＩ　１６４０培养基（美国Ｇｉｂｃｏ公司），ＣＤ３分选磁　珠、抗人ＣＤ２８单克隆抗体（ａｎｔｉ—ＣＤ２８　ｍＡｂ）（德国　Ｍｉｈｅｎｙｉ公司），１ｖ７５、Ｔ２２５细胞培养瓶（美国Ｃｏｒｎｉｎｇ　公司），抗人ＣＤ３单克隆抗体（ａｎｔｉ—ＣＤ３　ｍＡｂ，美国　ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司），重组人成纤维连接蛋白（ＲｅｔｒｏＮ—　ｅｃｔｉｎ，日本ＴａＫａＲａ公司），ａｎｔｉ—ＣＤ１９　ｓｃＦｖ—ＣＤ２８－　ＣＤ３‘ＣＡＲ、ａｎｔｉ—ＣＤ２２　ｓｃＦｖ—ＣＤ１３７一ＣＤ３‘一ｔＥＧＦＲ　ＣＡＲ（上海恒润达生公司），重组人白细胞介素一２　（ｒｈｌＬ一２，山东泉港药业公司），Ｊｕｒｋａｔ细胞株（Ｃｌｏｎｅ　Ｅ６．１，美国ＡＴＣＣ），重组生物素化蛋白·Ｌ（ｒｅｃｏｍｂｉ—　ｎａｎｔ　ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ，美国Ｐｉｅｒｃｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　公司），藻红蛋白（ＰＥ）标记链霉亲合素（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ—　ＰＥ，美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司），生物素化羊抗鼠ＩｇＧ，　Ｆ（ａｂ　）　抗体、生物素化羊抗人ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ　）　抗体　（美国Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ公司），ＣＤ３一ＡＰＣ—　Ｃｙ７、同型对照ＩｇＧ２　一ＡＰＣ—Ｃｙ７（美国ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ公　司），细胞活性染料（ｆｉｘａｂｌｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｄｙｅ，ＦＶＤ，美国　ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司）。非组织培养处理２４孔板（美国　Ｃｏｓｔａｒ公司），Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｏｐｔｉａ血细胞分离机（美国　Ｔｅｒｕｍｏ　ＢＣＴ公司），ＦＡＣＳ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩ流式细胞仪（美国　ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司），ＭｉｄｉＭＡＣＳ分选器（德国　Ｍｉｈｅｎｙｉ公司），ＫＲ２．５ｉ离心机（法国Ｊｏｕａｎ公司），　二氧化碳培养箱（美国Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ公司）。　１．３磁珠分选法分离Ｔ细胞用血细胞分离机采　集患者空腹状态下的单个核细胞约５　Ｘ　１０　个，Ｆｉ—　ｔｏｌｌ密度梯度离心法提取外周血单个核细胞（ｐｅ—　ｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣｓ），ＰＢＳ清洗　细胞２次，加入ＣＤ３分选磁珠（２０　ｔｘＬ／１０　ｃｅｌｌｓ），充　分混匀，４～８℃反应２０　ｒａｉｎ，加入Ｌｓ分离柱，阳性　选择，分选获得ＣＤ３　细胞，计数并且检测分选　纯度。　１．４　Ｔ细胞活化用含ｒｈＩＬ－２　５００　ＩＵ／ｍＬ、ａｎｔｉ—ＣＤ３　ｍＡｂ　５０　ｒｉｇ／ｍＬ、ａｎｔｉ．ＣＤ２８　ｍＡｂ　１００　ｎｇ／ｍＬ的ＲＰＭＩ　１６４０培养基调整细胞浓度为２×１０。／ｍＬ，加入　５　细胞培养瓶，置于３７　，５％ＣＯ　培养箱培养４８　ｈ。　１．５　Ｊｕｒｋａｔ细胞株培养Ｊｕｒｋａｔ细胞用含１０％胎牛　血清、１００　Ｕ／ｍＬ青霉素、１００　ｍＬ链霉素的ＲＰＭＩ　１６４０培养基培养传代。细胞悬浮生长，培养浓度为　１　Ｚ　１０　／ｍＬ。　１．６　ＣＡＲ逆转录病毒转染　预先用重组人成纤维　连接蛋白（３０　Ｉ￣ｇ／ｍＬ）包被非组织培养处理２４孔　板。每孔加入２　ｍＬ　ＣＡＲ逆转录病毒液（ａｎｔｉ—ＣＤ１９　ｓｃＦｖ－ＣＤ２８一ＣＤ３￣ＣＡＲ或ａｎｔｉ—ＣＤ２２　ｓｃＦｖ—ＣＤ１３７一　ＣＤ３∈－ｔＥＧＦＲ　ＣＡＲ），３２℃、２　０００　Ｘｇ离心２　ｈ，弃去　上清液。每孔加入１　ｍＬ活化的Ｔ细胞（０．５　Ｘ　１０。　个），３０℃、１　０００×ｇ离心１０　ｒａｉｎ，培养板置于３７　℃、５％ＣＯ　培养箱中培养２４　ｈ。吸取细胞，按上法　重复转染１次。　１．７　ＣＡＲ－Ｔ细胞培养将病毒转染后的细胞悬液　吸出，５００×ｇ、４℃离心１０　ｍｉｎ。用含５００　ＩＵ／ｍＬ　ｒｈＩＬ一２的ＲＰＭＩ　１６４０培养基重悬细胞，加入新的Ｔ７５　细胞培养瓶中，置于３７　、５％ＣＯ　培养箱中培养。　每天观察细胞的生长状况，适时补加含５００　ＩＵ／ｍＬ　ｒｈｌＬ一２的ＲＰＭＩ　１６４０培养基，调整细胞浓度为０．５×　１０。／ｍＬ，适时转３＂２２５培养瓶，培养１２～１４　ｄ获得　ＣＡＲ－Ｔ细胞。　１．８流式细胞方法分析ＣＡＲ—Ｔ细胞表型取１　Ｘ　１０。个ＣＡＲ—Ｔ细胞，加入３　ｍＬ　ＰＢＳ混匀，４００　Ｘ　ｇ离　心５　ｍｉｎ，吸净上清液，重复清洗２次，加入２００　Ｌ　ＰＢＳ重悬细胞。蛋白Ｌ组加入１　ｇ重组生物素化　蛋白Ｌ（５０　ｍＬ）；Ａｎｔｉ－ＩｇＧ组加入２　Ｌ生物素化　羊抗鼠ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ　）：抗体或生物素化羊抗人ＩｇＧ，　Ｆ（ａｂ　）　抗体。４℃反应４５　ｍｉｎ。重复清洗３次，加　入２００　ＰＢＳ重悬细胞。加入２０　Ｌ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ—　ＰＥ（１０￣ｇ／ｍＬ）及２０　Ｌ　ＣＤ３一ＡＰＣ—Ｃｙ７，４　ｏＣ避光反　应３０　ｍｉｎ。清洗１次，加入２００　ｔｘＬ　ＰＢＳ重悬细胞。　加入１０　细胞活性染料（５０　Ｌ／ｍＬ），４℃避光反　应３０　ｍｉｎ。清洗１次，加入４００　Ｌ　ＰＢＳ重悬细胞，　临『术检验杂　２０１８年４　Ｊｊ第３６卷第４期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｌａｂ　Ｓｃｉ，Ａｐｒ．２０１８，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．４　·２４３·　用流式细胞仪检测。ＦＶＤ染色设门去除死细胞所　致的非特异性染色，结果使用ＦＩｏｗＪｏ　１０软件分析。　２结　加入蛋白ＩｌＪ的实验组能检测到ＣＡＲ—Ｔ细胞群体，未　加入蛋白Ｌ的空白组雄以检测到ＣＡｌｌ—Ｔ细胞群体，　见图Ｉ。　滴度试验中分别加入蛋白Ｌ　０．０ｌ、０．１２５、０．２５、　２．１蛋白Ｌ和ｓｃＦｖ特异性结合的验证为验证蛋　０．５０、１．００、２．００、４．００　ｇ，结果显示ＣＡＲ－＇ｒ细胞表　白Ｌ能否和Ｓ￣ＹＦＶ特异性结合，选择来源于人急性Ｔ　细胞白血病的Ｊｕｒｋａｔ细胞株作为通　型Ｔ细胞，取　达率变化呈曲线形态，蛋白Ｌ结合ｓ（ｔＦｖ存在量效关　系，饱和结合后测定达到最高值，过量加入蛋白Ｌ　会影响实验结果。经过重复实验，最后确定在１　Ｘ　ｌ０　个细胞、２００　ＩｘＬ反应体积的染色方法中，蛋白Ｌ　最适合加入量是１．０　Ｉｘｇ，见图ｌ。结果间接证明蛋　白Ｌ能特异性结合到ＣＡＲ—Ｔ细胞的ｓｃＦｖ上。　对数生长期的Ｊｕｒｋａｔ细胞，用临床效果最为显著的　靶向ＣＤｌ９的ＣＡＲ（ａｎｔｉ—ＣＤＩ９　ｓｅＦｖ—ＣＤ２８一ＣＤ３‘　ＣＡＲ）转染，加人含ｒｈｌＬ．２　５００　ＩＵ／ｍＬ的ＲＰＭＩ　１６４０　培养基，诱导培养成ＣＡＲ—Ｔ细胞。　通过ＳＣＦＶ－ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ—ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ—ＰＥ一　流式细胞方法检测细胞上ＣＡＲ的表达，结果　示，　０．Ｏｌｐｌ￣　荧光强度　注：０．Ｏ（】　ｇ丧，Ｊ；空白组；Ｏ．（）Ｉ一４．０Ｏ　ｇ表示加入不同量蛋ｔ＇ｔ　１　的实验组　图ｌ蛋白ｌＪ滴度试验流式验证结果　２．２　基于蛋白Ｌ的染色方法检测肿瘤患者的ＣＡＲ—　ｕｔｉ４：ＤＩ９骶Ｆｖ－‘’Ｄ２８－ＣＤ￣‘＾－１．１．　Ｔ细胞　１例患者ａｎｔｉ．ＣＤ１９　ｓｅＦｖ．ＣＤ２８－ＣＤ３‘ｃＡＲ　转染的Ｔ细胞中ＣＤＩ９一ＣＡＲ—Ｔ细胞比例：蛋白Ｌ实　验组７１．６％、Ａｎｔｉ—ＩｇＧ对照组６４．２％，见图２；ａｎｔｉ—　ＣＤ２２　ｓ（‘Ｆｖ－ＣＤ１３７一ｃＤ３‘一ｔＥＧＦＲ　ＣＡＲ转染的Ｔ细胞　中ＣＤ２２一ＣＡＲ—Ｔ细胞比例：蛋白Ｌ实验组５３．１％、　Ａｎｔｉ—ｌｇＧ对照组４６．３％，见图３。另外Ｉ例患者　ＣＤＩ９一ＣＡＲ—Ｔ细胞比例：蛋白Ｌ实验组４９．３％、Ａｎｔｉ．　誊　曩　１ｇＧ对照组４３．８％；ＣＤ２２－ＣＡＲ—Ｔ细胞比例：蛋白Ｌ　实验组５６．５％、Ａｎｔｉ—ｌｇＧ对照组６４．０％。成组的实　验数据比较类似。结果表明ｓｃＦｖ—ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ—ｓｈ’ｅｐｔａｖｉｄｉｎ—ＰＥ流式细胞方法可用于肿瘤患者的　ＣＡＲ—Ｔ细胞的常规检测。　荧光强度　ｉ—ＪｇＧ对照组ＣＤＩ９一ＣＡＲ—Ｔ的流式　图２　蛋白Ｌ实验组／Ａｎｔ分析　·２４４·　口　临Ｊ术检验杂志２０１８年４月第３６卷第４期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｌａｂ　Ｓｃｉ，ＡｐＪ’．２０１８，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．４　ａｎｔｉ－（’Ｄ２２　Ｆ　—ＣＤＩ．１７·（’Ｄ＆￣－ｔＥＧＦＲ【’ＡＲ·Ｔ　由于靶抗原仅选择了ＣＤ１９、ＣＤ２０，常见的　ＣＤ２２、ＣＤ３０　ＣＤ３３、ＣＤＩ３８、ＰＳＭＡ　Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、　．ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＥＡ、ＧＤ２、ＦＡＰ、Ｇｌｙｐｉｃａｎ．３　１　ＨＥＲ２等ＣＡＲ需要进一步验证　。此外，蛋白ｌ　只能结合特定类型的轻链：人类ＶＫＩ、ＶＫｍ和ｖＫ１ｖ　型ｋａｐｐａ轻链，鼠类ＶＫＩ型ｋａｐｐａ轻链。　综上所述，我们利用蛋白Ｌ能特异结合免疫球　Ｃ●哪ＡｎｔＩ－Ｈ￣ｍｔＩ　Ｇ，ＳＡ－ＰＥ　，～¨矗＿Ｌ，Ｓ＾．Ｐ－【　蛋白和单链抗体ｋａｐｐａ型轻链的特性开发出新的流　式染色方法，通过单链抗体片段．蛋白Ｌ．生物素一亲　合素一荧光染料染色，经流式细胞仪测定ＣＡＲ的表　达。基于蛋白Ｌ的染色方法检测ＣＡＲ—Ｔ细胞具有经　荧光强度　图３蛋白Ｌ实验组／Ａｎｔｉ—ｌｇＧ对照组ＣＤ２２一ＣＡＲ—Ｔ的流式　分析　济性与通用性功能，将在评估细胞转染效率、细胞回　输量和细胞体内存活时间方面起到重要的作用。　４参考文献　［１］Ｓａｄｅｌａｉｎ　Ｍ，Ｒｉｖｉｅｒｅ　１，Ｒｉｄｄｅｌｌ　ｓ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ～１【·ｅｌｌ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５４５（７６５５）：４２３－４３１．　３　ｈｉ沦　｝｜前，流式细胞技术和ＰＣＲ法是检测ＣＡＲ．Ｔ　细胞常用的手段，如用ＰＥ标记的Ｂ细胞成熟抗原　（Ｂ—ｃｅｌｌ　ｎｌａｔｕｒａｔｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ，ＢＣＭＡ）／ＦＣ融合蛋白检　测ＢＣＭＡ—ＣＡＲ—Ｔ细胞　；采用Ａｌｅｘａ　４８８标记的　ＣＩ）１９ｓｌｇｌ－４融合蛋白检测ＣＤ１９一ＣＡＲ—Ｔ细胞　，靶　［２］（；ｒｕｐｐ　ＳＡ，Ｋａｌｏｓ　Ｍ，Ｂａｎ’ｅｔｔ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈｉｍｃ￣ｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｌ｛　－　ｍｏｄｉｆｉｅｄ…１＜：ｅｌｌｓ　ｔｂｒ　ａＣｔｌ｜ｅ　ｌｙｍｐｈｏｉ￣１　ｌｅｕｋｅｍｉａ［ｊ］．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ，　２０１３，３６８（１６）：１５０９一ｌ５１８．　抗原／Ｆ　ｃ·融合蛋白检测ＣＡＲ的特异性较好，但是重　绀融合蛋白成本、技术要求较高，且一种融合蛋白只　能检测一种ＣＡＲ。应用ＡＦ６４７标记的羊抗鼠ＩｇＧ抗　［３］Ｐｏｒｔｅｒ　ＤＩ　，Ｌｅｖｉｎｅ　ＢＬ，Ｋａｌｏｓ　Ｍ，　ａ１．Ｃｉｉｆｍｅｆｉ￣·ａｎｔｉｇｅｎ　ｌ　ｔ·ｅｐｌｏｒ·　ｍｏｄｉｉｆｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｌｙｍｐｈｏｉｄ　ｌｅｕｋｅｍｉａ［Ｊ］．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ，　２０１　１，３６５（８）：７２５－７３３．１）ＯＩ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａｌ　１０３８４９．　体检测ＰＳＣＡ．ＣＡＲ—Ｔ细胞　，此法虽然可以检测鼠源　ｆ，　ｓｃＦ’ｖ，但ｓｃＦｖ物种来源较多，而且不同的多克隆抗　［４］Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ　ＣＡ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ＳＡ，Ｒｅｓｔｉｔｏ　Ｎｌ’．Ｐｒｏｓｐｅ￣－Ｉｓ　！ｌｉｅ—ｅｎｇｉ－　ｎｅｅｒｅｄ…１　ｒｅｌｌ　ｉｍｆｕｔｍｏｔｈｅｒａｐｙ　ｆｏｒ　ｓｏｌｉ　ｃｔ　ｅａｌｌｅｅｒｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｍｅｄ．２０１　６．　２２（１）：２６　３６．ＤＯ１：１０．１０３８／ｎｎｉ．４０１５．　体导致　同的检测结果。Ｐｏｒｔｅｒ等　抽提患者ＰＢＭＣ　伞基　组ＤＮＡ，针　对ａｎｔｉ—ＣＤ１９　ＣＡＲ的转基因序列设　汁ｒｒａｑＭａ，１探针，用实时荧光定量ＰＣＲ方法检测　ＣＤＩ９一ＣＡＲ一．ｒ细胞，此法可用于微量细胞检测，但无　法检测细胞转染效率和其他类型ＣＡＲ—Ｔ细胞。　［５］Ｌａｋｈｒｉｆ　Ｚ，Ｐｕｇｎｉｅｒｅ　Ｍ，Ｈｅｎｒｉｑｕｅｌ　ｃ，ｅｌ　ａ１．Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ¨ｍｆｅｒ　Ｐｒｏ—　Ｉｅｉ１１　Ｌ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ａＪｌｙ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｆｒａｇｍｅｎｔ［Ｊ］．ＭＡｔ，ｓ，２０１６，８　（２）：３７９－３８８．ＤＯｌ：１０．１（）８０／ｌ９４２Ｏ８６２．２Ｏｌ５．Ｉ　１　１６６５７．　［６］Ａｌｉ　ＳＡ，Ｓｈｉ　Ｖ，Ｍａｒｉｃ　１，ｅｌ　ａ１．Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　１１１１　ａｎｔｉ—Ｂ　，ｅｌｌ　ｍａｔ－　ｕｒａｔｉｏｎ　ａｌ￣ｔｉｇｅｎ　ｃｌｉｆｍｅｒｉｃ　ｍｌｔｉｇｃｎ　ｒｅ（’ｅｌｌｆｏｒ　ｃａｕｓｅ　ｒｅｍｉｓｓｉｏｒＩｓ　ｏｆ　ｍｕｈｉｐｌｅ　ｍｙｅｌｏｍａ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ．２０１６，ｌ２８（１３）：１６８８—１７００　１）ＯＩ：１０．　１１８２／ｂｈ￣ｄ－２０ｌ６ｌｏ４－７ｌ１９０３．　本研究利用蛋白Ｌ能特异性结合抗体、单链抗　体ｋａｐｐａ型轻链的特性设计方案，ＣＡＲ—Ｔ细胞ｓｅＦｖ　［７］Ｄｅ　Ｏｌｉｖｅｉｒａ　ＳＮ，Ｗａｎｇ　Ｊ，Ｒｙａｎ　Ｃ，ｅｔ“ｚ　Ａ　ＣＤＩ９／Ｆ、（。ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉ—ＣＤｌ　９　ｒｈｉｍｅｒｉｔ’ａｔｔｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｊ　ｌ＇ｒａｔｌ　ｌ　Ｍｅｄ，２０１３．１１：２３．ＤＯｌ：１０．１１８６／１４７９－５８７６　１１—２３．　和生物素化蛋白１　饱和结合，生物素再结合荧光染　料标ｉｒｉＳ０链霉亲合素，最后通过流式细胞仪检测荧　光强度，问接测定ＣＡＲ　Ｔ细胞。实验结果表明，该　方法能够检测到ＣＤＩ　９一ＣＡＲ、ＣＤ２２一ＣＡＲ的表达。初　步表明基于蛋白Ｉ｜的染色方法可以检测ＣＡＲ—Ｔ细　［８］Ｐｏｒｔｍ　ＤＬ，Ｆｌｗａｎｇ　Ｗｑ、，Ｆｒｅｙ　ＮＶ，ｅｌ　ａ１．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ａｎｌｉｇｅｎ…·ｅ１）ｔｎｉ‘　’１　ｃｅｌｌｓ　ｐｅｒｓｉｓｔ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅ　ｓｕｓｔａｉｎｅｄ　ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｒｅｌａｐｓｅｄ　ｒｃｆｉａ（－ｔｏｉｆ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｔ·ｌｅｕｋｅｍｉａ［Ｊ］．ｓ【·ｉ　Ｉ＇ｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ，２０１５，７（３０３）：　３０３　ｒａ１３９．ＤＯＩ：１０．１　１２６／ｓｃｉｌｒａｎｓｌｍｅ￣１．ａａｃ５４１５．　胞。生物素一亲合素系统具有放大作用，蛋白Ｌ方法　的检测灵敏度应该更高。本研究选用的ａｎｔｉ。ＣＤ１９　ｓｅＦ、Ｖ一【２Ｄ２８一ＣＤ３￣ＣＡＲ、ａｎｔｉ—ＣＤ２２　ｓｃＦｖ—ＣＤ１３７一ＣＤ３∈一　［９］Ｊａｃｋｓｏｎ　ｔｔＪ，Ｒａｆｉｑ　Ｓ，Ｂｒｅｎｔ．ｉｅｎｓ　Ｐｄ．Ｄｒｉ＇，ｉ“ｇ　ＣＡｌｌ　Ｉ＇－ｃｅｉｌｓ　ｌｂｒｗａｒｄ　［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｅｏｌ，２０１６，１３（６）：３７０－３８３．１）Ｏ１：１０．　１（１３８／ｍｃｌｉｎｏｎｅ．２０１６．３６．　［１０］Ｇｉｌｌ　Ｓ，Ｍａｕｓ　ＭＶ，Ｐｏｒｔｅｒ　ＤＬ．Ｃｈｉｍｅｒｉ＜－ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｔ·ｅｐｔｏｒ　Ｔ　ｒｅｌｌ　ｔｈｍ’－　ａｐｙ：２５　ｙｅａｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍａｋｉｎｇ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ　Ｒｍ’．２０１６，３０（３）：　１５７．１６７　ｔＥＧＦＲ　ＣＡＲ的轻链都是ｋａｐｐａ型，其中ＣＤ１９。ＣＡＲ　的ｓｃＦ、ｖ为鼠源性、ＣＤ２２－ＣＡＲ的ｓｃＦｖ为人源性，初　步结果表明：只要ｓｃＦｖ轻链是ｋａｐｐａ型，无论ｓｅＦｖ　的靶向性和物种来源，基于蛋白Ｌ的流式细胞方法　都有望用于ＣＡＲ—Ｔ细胞的检测。　（收稿日期：２０１７．１２．１２）　（本文编辑：刘群）