第5章 培养基灭菌和空气除菌
教研室：生物工程 教师姓名： 余有贵 课程名称 授课内容 目的要求 发酵工艺学 培养基灭菌和空气除菌 授课专业及班次 09级食品科学和工程方向 授课方式及学时 讲授和自学、8H 掌握工业用培养基湿热灭菌的原理和方法、不同空气除菌流程的特点，熟悉发酵工业对无菌空气质量的要求和介质除菌过滤的机理，了解空气过滤器的特性。 （1）教学重点：培养基的湿热灭菌、空气的介质过滤除菌 （2）教学难点：培养基连续灭菌和空气的介质过滤除菌的流程选择 （1）灭菌的意义和方法 （2）培养基的湿热灭菌 （3）空气的除菌 （4）无菌检测及发酵废气废物的安全处理 （1）田洪涛.现代发酵工艺原理和技术.化学工业出版社,2007 （2）余龙江.发酵工程原理和技术使用.化学工业出版社,2006 （3）俞俊棠,唐孝宣等.新编生物工艺学.化学工业出版社,2003 （4）姚汝华主编.微生物工程工艺原理(第二版).广州:华南理工大学出版社,2005 重点和难点 讲授内容及 时间分配 参考资料 教学过程
一、灭菌的意义和方法
1、灭菌的意义
采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌，例如各种高温灭菌措施等。
保证纯种发酵，防止杂菌和噬菌体污染。
消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。 2、灭菌的方法
（1）火焰灭菌：接种时使用, 灼烧是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌
（2）干热灭菌法：适于灭菌后要求保持干燥状态的物料，将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在150～170℃下维持1～2小时后，即可达到彻底灭菌的目的。在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。
（3）湿热灭菌法：多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5～10min后即可杀死；酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80℃以上的温度处理才能杀死；而细菌的芽孢最耐热，一般要在120℃下处理15min才能杀死。
工业生产上广泛使用，常用120℃，20-30min。
（4）射线灭菌法：适于表面灭菌，紫外线波长在2600埃左右灭菌效力最强，一般用30瓦紫外灯照射20-30min
（5）化学药剂灭菌：
1）0.1%-0.25%的高锰酸钾溶液:皮肤消毒 2）2%-5%漂白粉:用具和车间环境的灭菌 3）70%-75%酒精溶液:皮肤和玻璃器皿表面灭菌 4）0.25%新洁尔灭: 皮肤、小器皿表面和车间的灭菌
5）0.5%甲醛:用于无菌室、空罐和车间空间的灭菌，10ml/m,6-12h （6）高压静电灭菌：使用于空气的灭菌
(7）介质过滤除菌：滤除血清和抗生素溶液内的微生物和空气过滤除菌。
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二、培养基和设备的湿热灭菌
1、湿热灭菌的原理 1.1概念
致死温度：杀死微生物的极限温度。
致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。
热阻：微生物在某一特定的条件下的致死时间性，表示微生物对热的抵抗力。 1.2原理
湿热灭菌的基本原理：湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌。蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。
用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求是：既要达到一定的灭菌程度，又要尽量减少营养成分的破坏。
1.3微生物的热死规律----对数残留定律
对数残留定律：微生物的死亡速率dN/dθ和任何一瞬间残存的活菌数成正比,即
dN/dτ=KN
式中：N----活菌数（个／ml）
τ----受热时间（S）
k----比死亡速率（S），和微生物种类和加热时间有关 在恒温下，当τ=0,N=N0时，可得： 理论灭菌时间
τ =(2.303/k)log(No/Ns)
τ-- -灭菌时间（秒）
k---比死亡速率，和菌的种类和加热温度有关（s
－１
-1
）
No---灭菌开始时，污染的培养基中杂菌个数（个／ml） Ns---经过灭菌时间τ后，残存活菌个数（个／ml）
1）杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但其受热被杀死，主要原因是高温能使蛋白质变性，这种反应属和单分子反应，因此杂菌在一定温度下受热死亡也遵循单分子反应方程。
2）从上式可知：要做到绝对无菌，即N=0，则时间τ将无限大。故在实际计算中取N=10，即每处理1000批中只残留一个活菌数，该值在工程上已足够了。 1.4 灭菌温度和菌死亡反应速度常数的关系
k=Ae
等于反应速度
△E—活化能，J/mol
A——阿累尼乌斯常数（sT——绝对温度（K）
－１
-3
-⊿E/RT
式中：K——菌死亡的速度常数（s－１），当反应物的浓度为单位浓度时，则反应速度常数在数值上
）
R——气体常数（8.314J／mol.K）
1.5培养基成分受热破坏规律（看作一级反应）
-dc/dt=kdc
式中：C为对热敏性物质的浓度；kd为分解速率常数（s
－１
），
1.6高温快速灭菌法优于低温长时间灭菌法：当灭菌温度升高时，菌的比死亡速率增加较培养基成分分解速率常数快，因而在较高的温度下可以缩短灭菌时间而保留较多的营养物质。 2、影响培养基灭菌的因素
（1）培养基中的颗粒和物理状态 培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。
培养基的物理状态对灭菌具有极大的影响，固体培养基的灭落时间要比液体培养基的灭菌时间长，假如lOO℃时液体培养基的灭菌时间为1h，而固体培养基则需要2～3h才能达到同样的灭菌效果。其原因在于液体培养基灭菌时，热的传递除了传导作用外还有对流作用，而固体培养基则只有传导作用而没有对流作用，另外液体培养基牛水的传热系数要比有机固体物质大得多。
（2）培养基中的微生物数量 不同成分的培养基其含菌量是不同的。培养基中微生物数量越多，达到无菌要求所需的灭菌时间也越长。天然基质培养基，特别是营养丰富或变质的原料中含菌量远比化工原料的含菌量多，因此，灭菌时间要适当延长。含芽孢杆菌多的培养基，要适当提高灭菌温度并延长灭菌时间。
（3）培养基成分 油脂、糖类、蛋白质都是传热的不良介质，会增加微生物的耐热性，使灭菌困难。高浓度的盐类，色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌。如大肠杆菌在水中加热至60～65℃便死亡，在10 %的糖液中，需70℃处理4～6 min，而在30％的糖液中则需70℃处理30min. 低浓度(1％～2％)的NaCI溶液对微生物有保护作用，但随着浓度的增加，保护作用减弱，浓度达8％～10％以上，则减弱微生物的耐热性。
（4）培养基pH
pH值对微生物的耐热性影响很大，pH为6.0 ~ 8.0时微生物最不易
死亡， pH <6.0时,氢离子易渗入微生物的细胞内,改变细胞的生理反应促使其死亡。所以培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。
表5-1 pH对灭菌时间的影响 温度／℃ 孢子数／(个／毫升) 灭菌时间／min pH 6.1 pH 5.3 8 25 70 340 7 25 65 720 pH 6.5 5 12 35 180 pH 4.7 3 30 30 150 pH 4.5 3 13 24 150 120 115 110 105 10000 10000 10000 10000 （5）泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，对灭菌极为不利。因此对易产生泡沫的培养基进行灭菌时，可加入少量消泡剂。 3、消除高温有害影响的措施
（1）采用特殊加热灭菌法
（2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液和其他成分分别灭菌后再合并； （3）对含Ca或Fe的培养基和磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；
（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下灭菌15分钟）或间歇灭菌；
（5）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌 4、培养基灭菌方式 4.1分批灭菌
1）概念：将配制好的培养基置于发酵罐中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起加热灭菌的操作过程，叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。包括：加热、维持和冷却三个阶段。
2) 操作要点
三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。
开始灭菌时，应排放夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，夹套内通入蒸汽。当发酵罐的温度升至70℃时，开始由空气过滤器、取样管和放料管通人蒸汽，当发酵罐内温度达到120℃，压力达到l×10Pa(表压)时，灭菌进入保温阶段。在保温阶段，凡液面以下各管 道都应通蒸汽，液面以上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定直到保温 结束。再依次关闭各排气、进气阀门，并通过空气过滤器迅速向罐内通入无菌空气，维持发酵罐降温过程中的正压，且在夹套或蛇管中通入冷却水，使培养基的温度降到所需温度。 4.2 连续灭菌
（1）空罐灭菌
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2+
3+
空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为空罐灭菌。
为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。
（2）培养基连续灭菌
1） 概念：将配制好的培养基在通入发酵罐之前，进行加热、保温和降温的灭菌过程，叫做连消。
2）优点：连续灭菌可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小。组成培养基的耐热性物料和不耐热性物料可在不同温度下分开灭菌，以减少物料至受热破坏的程度，也可将糖和氮源分开灭菌，以免醛基和氨基受热发生反应生成有害物质。
3）流程
A、喷淋冷却连续灭菌流程
喷淋冷却连续灭菌流程是常用的连续灭菌流程(见图5—1)。培养基由配料罐放出，通过蒸汽预加热后，用连消泵送入气液混合器或连消塔底端，料液被加热到灭菌温度(130℃)后，由顶部流出，进入维持罐，维持8～25min，再由维持罐上部侧面管道流出，维持罐内最后的培养液由底部排尽，经喷淋冷却器冷却到发酵温度，送入发酵罐。
图5-1 喷淋冷却连续灭菌流程
B、喷射加热连续灭菌流程
图5-2 喷射加热连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程也是常用的连续灭菌流程(见图5—2)。蒸汽直接喷人培养基，
因此培养基急速升温到预定的灭菌温度，在此温度下的保温时问由维持段管子的长度来保证，灭菌后培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器，急速冷却。该流程由于受热时间短，故温度可升到140℃而不会引起培养基的严重破坏。该流程能保证培养基先进先出，避免过热或 灭菌不彻底的现象。
C、薄板式换热器连续灭菌流程
图5-3 薄板式换热器连续灭菌流程
薄板式换热器连续灭菌流程是较为节能的流程(图5—3)。该流程采用了薄板换热器作为培养基的加热器和冷却器，蒸汽在薄板换热器的加热段使培养基的温度升高，经维持段保温一段时间，然后在薄板换热器的冷却段进行冷却，从而使培养基的预热、灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。虽然加热和冷却培养基所需时间比使用喷射式连续灭菌稍长，但灭菌周期则比间歇灭菌小得多。由于生培养基的预热过程就是灭菌培养基的冷却过程，所以节约 了蒸汽及冷却水的用量，故该流程的能量利用比较合理。
4.3发酵培养基及设备管道灭菌技术
①种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌 从有关管道通入蒸汽， 使罐内蒸汽压力达O.147MPa，维持45min，灭菌过程中，从所有液位以上的阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过这些阀门以防止出现死角。灭菌完毕后关闭蒸汽，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保压O.098MPa。
②空气总过滤器和分过滤器灭菌 排出过滤器中的空气，从过滤器上部通人蒸汽，并从上、下排气口排蒸汽，维持压力O.147MPa灭菌2h。灭菌完毕，通入压缩空气吹干。 ③种子培养基实罐灭菌 从夹层通入蒸汽间接加热至80℃，再从取样管、进风管、接种管等液面以下的阀门通人蒸汽，进行直接加热。同时关闭夹层蒸汽进口阀门、升温至121℃，维持30min。期间，所有液面以上的阀门保持一定时间的排蒸汽状态。
④发酵培养基实罐灭菌 从夹层或盘管式热交换器进入蒸汽，间接加热至90℃，关闭夹层及盘管蒸汽，从取样管、进风管、放料管等液面以下的阀门通入蒸汽，直接加热至12l℃，
维持30min。在此期间，所有液面以上的阀门保持一定时间的排蒸汽状态。
⑤发酵培养基连续灭菌一般培养基的连续灭菌采用灭菌温度为130℃，维持5min。
⑥补料实罐灭菌 根据料液不同而异，淀粉料液为121℃，维持5～lOmin。尿素溶液灭菌为105℃，维持5min。
⑦消泡剂灭菌 直接加热至121℃，维持30min。
⑧杀菌锅内灭菌 固体培养基灭菌蒸汽压力0.098MPa，维持20～30min；液体培养基灭菌蒸汽压力0.098MPa，维持15～20min。
三、空气的除菌
1、好气性发酵对无菌空气的要求
（1）连续提供一定流量的压缩空气。VVM----单位时间(min)单位体积(m)培养基中通入标准状况下空气的体积(m),一般为0.1—2.0.
（2）空气的压强（表压）为0.2—0.4 MPa。 （3）进入过滤器之前，空气的相对湿度Φ≤70%； （4）进入发酵罐的空气温度可比培养温度高10—30 ℃；
（5）压缩空气的洁净度，在工程设计上，一般要求1000次使用周期中，只允许有1个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=102、空气除菌的方法
（1） 辐射杀菌：最常用的是用紫外光线进行无菌室灭菌。2537Å波长的紫外线具有极强烈的杀菌效力，它的主要作用是使微生物的DNA分子产生的胸腺嘧啶的二聚体，导致细胞死亡。
无菌室常用的紫外灯功率为30W，安装在操作台上方一米左右高处，每次照射15-30min既可。
紫外线有很强的杀菌力，但穿透力很弱，一张薄纸即可完全挡住紫外线，因此待灭菌物品必须置于紫外光直接照射下，而且在一定范围内作用强度和距离平方成反比。
此外，紫外线对人体组织有一定刺激作用，眼睛、皮肤受照射后会产生某些症状，所以工作人员在无菌室操作时应关闭紫外灯
（2）热杀菌 基于加热后微生物体内的蛋白（酶）热变性而得以实现。 热空气进入培养系统之前，一般均需用压缩机压缩，提高压力。
空气压缩后温度能达到200度以上，保持一定时间后，便可实行干热杀菌。 利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌的原理对制备大量无菌空气有特别意义。
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3
3
实际使用中需考虑培养装置和空气压缩机的相对位置，连接压缩机和培养装置的管道的灭菌以及管道长度等。
（3） 静电除菌 静电除尘器可除去空气中的水雾、油雾、尘埃，同时也除去微生物。 原理：利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌目的。 对于一些直径小的微粒，所带电荷小，不能被吸附而沉降。
（4） 过滤除菌 介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌的目的。
从可靠性，经济适用和便于控制等方面考虑，目前仍以介质过滤法较好，也是大多数发酵厂广泛采用的方法。 3、介质过滤除菌机制
介质过滤除菌的机制主要有以下几种，至于哪种作用机制为主，随条件而变化。 （1）惯性碰撞滞留作用：空气气流流速大时，气流中的微粒具有较大的惯性力。当微粒随气流以一定速度向纤维垂直运动因受纤维阻挡而急剧改变运动方向时，由于微粒具有的惯性作用使它们仍然沿原来方向前进碰撞到纤维表面，产生摩擦粘附而使微粒被截留在纤维表面，这种作用称惯性碰撞截留。
截留区域的大小决定于微粒运动的惯性力，所以，气流速度愈大，惯性力大，截留效果也愈好。此外，惯性碰撞截面作用也和纤维直径有关，纤维愈细，捕集效果愈好。惯性碰撞截面在介质除尘中起主要作用。
（2）阻拦滞留作用：微粒随空气气流向前运动，当气流为层流时，随气流运动的粒子在接近纤维表面的部分由于和过滤介质接触而被纤维吸附捕集，这种作用称之为阻拦截留。
空气流速愈小，纤维直径愈细，阻拦截留作用愈大。但是在介质过滤的除尘除菌中，阻拦截留并不起主要作用。
（3）布朗扩散作用：直径小于1μ的微粒在运动中往往产生—种不规则的布朗运动，使微粒间相互凝集成较大的粒子，从而发生重力沉降或被介质敲留。但是这种作用只有在气流速度较低时才较显著。
（4）重力沉降作用：重力沉降是一个稳定的分离作用，当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就容易沉降。
就单一的重力沉降情况下，大颗粒比小颗粒作用显著，对于小颗粒只有在气流速度很慢时才起作用。
一般它是和拦截作用相配合的，即在纤维的边界滞留区内，微粒的沉降作用提高了拦
截滞留的捕集效率。
（5）静电吸附作用：干空气对非导体的物质相对运动磨擦时，会产生诱导电荷，纤维和树脂处理过的纤维，尤其是一些合成纤维更为显著。
悬浮在空气中的微生物微粒大多带有不同的电荷，如枯草杆菌孢子20%带正电荷，20%带负电荷，15%中性， 这些带电的微粒会受带异性电荷的物体所吸引而沉降。
此外，表面吸附也归属于这个范畴，如活性炭的大部分过滤效能应是表面吸附的作用。 4、常用的滤菌介质
（1）棉花 （2）活性炭 （3）玻璃纤维 （4）超细玻璃纤维纸 （5）石棉滤板 （6）烧结材料过滤介质 （7）绝对过滤介质：微孔膜 5、空气净化流程
（1）一级冷却析水、加热的空气净化流程图
图5—4 一次冷却一次析水的空气预处理流程
l一高空采风；2一粗过滤器；3一空压机；4一冷却器；5，6一析水器；
7一贮气罐；8一加热器；9一总过滤器；10一分过滤器
将压缩空气冷却至露点以下，析出部分水分，然后升温使相对湿度为60％左右，进入空气过滤器。根据气候情况有一次冷却一次析水流程(见图5—4)、二次冷却二次析水流程(见图5—5)。这两种流程适用于空气湿含量较大的地区。
（2）二级冷却析水、加热的空气净化流程图
图5—5 二次冷却析水、加热的空气预处理流程
1一高空采风；2一粗过滤器；3一空压机；4，6一冷却器；5，7一析水器； 8一贮气罐；9一加热器；10一空气总过滤器；11一空气分过滤器 （2）高效前置过滤除菌流程
１、高效前置过滤器 ２、压缩机 ３、贮罐 ４、冷却器 ５、丝网分离器 ６、加热器 ７、过滤器
（3）利用热空气加热冷空气的空气净化流程图
图5—7 利用热空气加热冷空气的流程
l一高空采风；2一粗过滤器；3一空压机；4一热交换器；5一冷却器；6，7一析水器；8一总过滤
器；9一分过滤器
利用压缩后的热空气和冷却后的冷空气进行热交换，使冷空气温度升高，降低相对湿度，如图5—7所示。此流程对热能利用较合理，热交换器还兼做贮气罐，但由于气一气换热的传热系数很小，加热面积要足够大。
（4）冷热空气直接混合式空气净化流程图
图5—8 冷热空气直接混合的流程
1一高空采风；2一粗过滤器；3一空压机；4一冷却器；5，6一析水器；7一贮气罐；8一总过滤器；9一
分过滤器
将压缩后的空气一部分冷却析水，另一部分热空气直接和冷却析水后的空气混合，然后进入空气过滤器，如图5—8所示。此流程适用于空气的湿含量中等的地区。其对热能利用合理，但操作要求较高，要经常根据条件调节两部分空气的混合比。 （5）将空气冷却至露点以上的流程
图5—9 将空气冷却至露点以上的流程
1一高空采风；2一粗过滤器；3一空压机；4一冷却器5一贮气罐；6一空气总过滤器；7一空气分过滤器
将压缩空气冷却至露点以上，使进入过滤器的空气相对湿度为60％～70％，如图5—9所示。这种流程适用于北方和内陆气候干燥地区。 6、提高过滤除菌效率的措施
（1）针对不同地区，设计合理的空气预处理设备，选择合适的空气净化流程，以达到除油、水和杂质的目的。
（2）设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。
（3）保证进口空气清洁度，如加强生产场地卫生管理，正确选择进风口，加强空气压缩前的预处理。
（4）降低进入空气过滤器的空气相对湿度，如使用无油润滑的空气压缩机，加强空气冷却和去油，提高进入过滤器的空气温度。
（5）稳定压缩空气的压力，采用合适容量的贮气罐。
四、无菌检测及发酵废气废物的安全处理
自学
思考题
1、培养基湿热灭菌的原理是什么？
2、设计一个培养基连续灭菌流程，并说明原理。 3、简述发酵用无菌空气的质量指标。
4、试设计一个空气除菌流程图，并说明各设备的主要作用。 5、介质过滤除菌的机理是什么？ 6、如何提高过滤除菌的效率？
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