成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性

LETTERSINBIOTECHNOLOGYVol.28No.6Nov.,2017doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2017.06.021

823研究报告

成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性

陈雪梅a，薛斯亮b，吴思思a

四川大学华西医院a.公共实验技术中心；b.皮肤性病科；四川成都610041

［摘要］目的：建立一种周期短、成本低的成年小鼠原代皮肤成纤维细胞分离培养方法，并探索其生物学特性。方法：取8~12周龄BALB/c小鼠背部、尾尖、耳部皮肤，配制2种血清的细胞培养液，采用组织块贴壁法、酶消化法、酶消化组织块贴壁法进行原代皮肤成纤维细胞的培养，通过显微镜观察比较原代细胞的数量、形态、培养周期及纯度；通过免疫荧光、CCK-8、UVB辐照、流式细胞术进行生物学特性鉴别。结果：背部皮肤组织块贴壁使用Gibco胎牛血清培养7d无细胞游出，CLARK特级胎牛血清细胞游出较多。背部皮肤经酶消化法得到细胞贴壁少；经组织块贴壁法细胞生长慢，培养周期长；酶消化组织块贴壁法细胞游出速度快、数量多、呈长梭形。尾尖取材量少，得到细胞少；耳部皮肤取材方便，但细胞纯度低。CCK8增殖曲线呈S型；相较于对照组，UVB辐照后细胞凋亡率增高17%。结论：CLARK特级胎牛血清、背部皮肤取材、酶消化组织块贴壁法是培养成年小鼠原代皮肤成纤维细胞最优的方案，可增加细胞得量、缩短培养周期，降低成本。［中图分类号］Q813.1

［关键词］成年小鼠；原代皮肤成纤维细胞；酶消化法；组织块贴壁法

［文献标识码］A

［文章编号］1009-0002（2017）06-0823-05

SeparationandBiologicalCharacteristicsofPrimarySkinFibroblastsfromAdultMiceSkin

a.CoreFacility;b.Dermatology＆STD;WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China

CHENXue-Meia,XUESi-Liangb,WUSi-Sia*

*Correspondingauthor,E-mail:949189109@qq.com

［Abstract］Objective:Toestablishtimeandcostsavedmethodforculturingadultmiceprimaryskinfibro⁃blasts,andtoexploreitsbiologicalcharacteristicsbyimmunofluorescenceassay.Methods:Thebackskin,tailtipskinandearskinwerestripingfromadultmice（8~12weeks）,wechosetwodifferentDMEMhighglucoseex⁃herencemethodtocultureadultmiceprimaryskinfibroblasts.Evaluatethosemethodsbymicroscopicobservation

tracts,threemethodsincludingtissueadherencemethod,enzymedigestionmethodandenzymedigestiontissuead⁃throughthecellnumbers,thecellstatus,thelengthofculturecycleandcells'purity.Thebiologicalcharacteris⁃ticsofthecellswereidentifiedbyimmunofluorescence,CCK-8andflowcytometry.Results:Whenusingtissuelittlecellmigrateout,theCLARKFBShasmuchmorecellmigration.Thebackskinwaschosentocomparetheadherentmethodtocultureprimaryfibroblastsofadultmice'sbackskin,theGibcofetalbovineserum（FBS）hasdifferentculturemethods.Whenusingenzymedigestionmethod,averysmallamountcellswerereceivedandithasaterriblestatus,thetissueadherencemethodcanprovidemorecells,butittooklongtimefortheprimary

收稿日期：2017-06-27基金项目：青年科学基金（81502747）作者简介：陈雪梅（1990-），女，学士，助理实验师，（E-mail）731078695@qq.com通信作者：吴思思，（E-mail）949189109@qq.com

824生物技术通讯

LETTERSINBIOTECHNOLOGYVol.28No.6Nov.,2017celltomigrateout.Themethodcombiningtheenzymedigestionandtissueadherencecanprovidemorecellsand

shortentheculturecycle.Aboutthepurityofcells,backskinwashigherthanthatofthetailtipskin,thetailtipskinwashigherthantheearskin.TheproliferationcurveofprimaryskinfibroblastswaspresentedatypicalTheoptimalmethodforprimaryskinfibroblastscultureistheClarkgradefetalbovineserumtotalextracts,adultnumberofcells,shortentheculturecycle,reducethecost.

\"S\"type.Comparedwiththecontrolgroup,UVBirradiationincreasedtheapoptosisrateby17%.Conclusion:micebackskinextraction,andenzymedigestiontissueadherencemethod.Thiscombinationcanprovidealarge［Keywords］adultmice;primaryskinfibroblasts;enzymedigestionmethod;tissueadherencemethod

皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成，成纤维细胞是真皮层主要构成细胞，能促进表皮细胞迁移、增殖和分化，分泌大量胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，是皮肤组织受损或衰老后的主要修复细胞[1-2]。原代皮肤成纤维细胞生物性状尚未发生较大变化，能较好地反映体内生长特性，因此广泛用于药理、毒理、药效试验[3]。已有文献报道通过组织块贴壁法取新生小鼠背部皮肤获得成纤维细胞[4]，但研究成年体细胞的意义远大于幼体细胞[5]。成年小鼠毛发较多难以去除、带有毛发的皮肤不易有效培养成纤维细胞、成年小鼠来源的成纤维细胞活性略差[4]，因而针对其培养还鲜有文献报道。

组织来源是小鼠皮肤原代成纤维细胞培养成功的要素，有报道通过尾尖[6]、耳部[7]、背部[4]等部位进行皮肤取材，主要采用酶消化法和组织块贴壁法[8]，另有作者将两方法联合称为酶消化组织块贴壁法进行滑膜成纤维细胞[9]、髓核细胞[10]、肺成纤维细胞[3]等原代细胞培养。我们在成年小鼠尾尖、背部、耳部3个部位组织取材，采用组织块贴壁法确定最佳取材部位；通过成年小鼠背部皮肤取材，采用酶消化法、组织块贴壁法、酶消化组织块贴壁法3种方法确定最佳培养方法。原代培养过程中，血清的选择至关重要，试验选择2种不同类型的血清，通过优化培养方法、取材部位，建立一套最高效可行的培养方案。

清（FBS）（Gibco公司，10099-141）；澳洲特级FBS（CLARKBioscience公司，FB25015）；DMEM高糖培养基、双抗、胰酶（Hyclone公司）；牛血清白蛋白（碧云天公司）；鼠抗人波形蛋白单克隆抗体（武汉艾美捷科技有限公司）；CCK8（日本同仁公司，CK04）；流式凋亡检测试剂盒（KGA106）、流式周期检测试剂盒（KGA511）（凯基生物公司）；波形蛋白（正能生物公司）。1.2

成年BALB/c小鼠断颈处死，75%酒精浸泡5取材及预处理

min，PBS洗3次，固定，备皮，取尾尖、背部或耳部皮肤置于含PBS的平皿里，小心剥离脂肪、血管h，分离真表皮，去除表皮，PBS清洗3次。1.31.3.1

细胞贴壁法酶消化法

取小鼠背部皮肤，经上述预处

等多余组织，PBS洗3次，加胰酶1~2mL消化2

理后，加入10mLⅠ型胶原酶（1mg/mL），37℃水基终止消化，取上清离心收集细胞。1.3.2

肤，经上述预处理后于安瓿瓶内尽量剪碎，PBS清底部。1.3.3

组织块贴壁法

浴振荡消化2h，再加入等体积DMEM完全培养

取小鼠背部、尾尖、耳部皮

洗3次，吸弃上清，分别将组织块均匀铺在培养皿

酶消化组织块贴壁法

取小鼠背部皮肤，

经上述预处理后于安瓿瓶内尽量剪碎，吸弃上清，加7mL胰酶，于37℃水浴锅中消化1h，加入

1

1.1

材料与方法

SPF级BALB/c小鼠，8~12周龄，性别不论，由材料

DMEM完全培养基终止消化，经PBS清洗后均匀铺在培养皿底部，加少量培养液（没过组织块）。1.4

细胞培养

加入10%Gibco血清完全培养液与10%

成都达硕实验动物有限公司提供。澳洲胎牛血

CLARK血清完全培养液，在37℃、5%CO2培养箱

中培养细胞，第2d补加培养液至正常量，每2~

陈雪梅等：成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性825

31.5

d换液。取第成纤维细胞免疫荧光鉴定

3代细胞3.0×104个接种至24孔板，待细

胞融合度达70%左右时弃培养基，加4%多聚甲醛固定15min，5%BSA封闭30min，加入鼠抗人波形蛋白单抗（1∶1000），4℃过夜，再加400μLFITCL标记的山羊抗小鼠IgG，室温21.6

DAPI取成纤维细胞增殖曲线测定

染细胞核5min，显微成像。h，0.1mmol/第3代细胞接种至96孔板，5.0×103天加入10μLCCK8试剂，37℃、5%CO/孔2检测D培养，箱隔

中反应1h，450nm作图。值，连续检测7d，记录并

1.7

取第流式细胞凋亡检测

4代细胞铺板，1.0×105组不做处理；辐照组每天接受中波紫外线/孔，分2组：（UVB对照

，290~320nm）辐照300J/m2，辐照3d后收集细胞进行流式凋亡检测。

2结果

2.1细胞

不同血清组织块贴壁法培养背部皮肤成纤维培养至第7d，采用Gbico血清的组织块基本无细胞游出，而用CLARK血清的组织块可见大量细胞游出（图1）。2.22.2.1

不同取材部位进行原代培养的比较

成年小鼠尾尖取材原代成纤维细胞培养

图A2：第成年小鼠尾尖皮肤原代成纤维细胞纤维显微图像

3d；B：第4d；C：第7d；D：传代至第2代细胞取小鼠尾尖组织约2cm，剪碎后铺板，第3d有细胞游出（图2A），第4d细胞开始恢复形态（图2B首次传代获得的尾尖皮肤成纤维细胞，），第7d细胞数量大大增加（图2C），大部分呈

图2D为长梭形，有少量杂细胞。2.2.2

取小鼠耳部皮肤，成年小鼠耳剪碎铺板，部皮肤原第代3成d纤没有细胞游出维细胞培养

3A），第4d仅有少量细胞游出（图3B），第7

d第细胞数量有所增多2代成纤维细胞，（图视野内可见多种细胞，3C），图3D为首次传代后大部分细胞呈圆形，与成纤维细胞形态差异较大，细胞纯度较低。2.2.3

取小鼠背部皮肤剪碎铺板，成年小鼠背部皮肤原第代3成d纤可见组织块边维细胞培养缘有细胞游出，但还未恢复形态（图4A），第4d

细胞开始恢复形态（图4B），第7d细胞数量大大增加（图4C），图4D为首次传代后第2代成纤维细胞，形态均一，呈长梭形，折光性好。2.3

取原代培养方法的比较

小鼠背部皮肤，剪碎后分别采用酶消化法、组织块贴壁法、酶消化组织块贴壁法进行原

图A1：Gibco不同血清培养原代成纤维细胞显微图像

胎牛血清；B：ClARK特级胎牛血清

图3A：成年小鼠耳部皮肤原代成纤维细胞培养显微图像第3d；B：第4d；C：第7d；D：传代至第2代细胞

（×100）

（图826代培养。图5A为酶消化法得到的原代细胞，贴壁细胞少，状态差，传代难以存活；图5B是采用组织块贴壁法培养9d后得到的细胞，细胞游出速度较慢，细胞量少；图5C、D是采用酶消化组织块贴壁法培养9d后的细胞量，细胞得量多，轮廓清晰，折光性强，呈长梭形。

2.4小鼠原代成纤维细胞生物学特征

经上述对比试验，最终选择CLARK特级胎牛

血清、酶消化组织块贴壁法、背部皮肤取材的方式培养原代皮肤成纤维细胞，并对其生物学特性进行鉴定。2.4.1

胞进行免疫荧光鉴定，免疫荧光鉴定

图选取第6中红色荧光为原代皮3代皮肤成纤维细

肤成纤维细胞中的波形蛋白，蓝色为DAPI着色的细胞核。成纤维细胞呈长梭状，部分有分支，纯度在95%以上。2.4.2

胞进行增殖曲线测定

增殖曲线的测定选取第，CCK83法代皮肤成纤维细

检测D450nm以培养时间为横坐标、D值。7，细胞2d后进入指数生450nm长平均值为纵坐标做图期，第3~6d为对数

图A4：第成年小鼠背部皮肤原代成纤维细胞培养显微图像

3d；B：第4d；C：第7d；D：传代至第2代细胞图6原代皮肤成纤维细胞免疫荧光鉴定生LETTERS物IN技BIOTECHNOLOGY术通讯

Vol.28No.6Nov.,2017生长期，随后进入平台期，增殖曲线呈“S”型。2.4.3

流式凋小亡鼠检皮测

肤原选代取成第纤4维代细成胞纤经维UVB细胞处，理接后

受

UVB凋亡检测。未做任何处理的对照组，辐照300J/m2,辐照3d后收集细胞进行流式凋亡细胞占比不到10%（图8A），而经UVB处理后的原代成纤维细胞（图8B）凋亡率达27.67%，可见该方法培养的原代皮肤成纤维细胞具有良好的生物学活性，对UVB的刺激反应正常。

3讨论

皮肤成纤维细胞是重要的组织构成细胞，能

分泌和合成胶原蛋白、弹性蛋白及多种细胞修复因子[11]，真皮层中的胶原蛋白大多由成纤维细胞分泌而来，因而成纤维细胞的多少决定了胶原蛋白的多少[12]。皮肤衰老是一个复杂的生物学过程，包括内源性自然衰老和受环境因素影响的外源性衰老，后者主要是由日光中紫外线照射所致，即光老化[13]，成纤维细胞是这个过程中的主要

图5A：不同方法培养成年小鼠背部皮肤原代成纤维细胞显微图像

酶消化法；B：组织块贴壁法；C，D：酶消化组织块贴壁法

图7原代皮肤成纤维细胞增殖曲线

陈雪梅等：成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性827

图8

A原代皮肤成纤维细胞流式检测

：对照组；B：UVB处理组

修复细胞之一[14]。此外，皮肤成纤维细胞还广泛应用于皮肤美容[15]、皮肤病[16]等相关研究。原代培养的细胞更能接近和反映体内生长特性[17-18]，建立一种高效可行的成年小鼠皮肤成纤维细胞的原代培养方法尤为重要。

基于成年小鼠备皮困难、细胞活性差[4]

等特点，根据多批次、长时间的培养，使用CLARK特级胎牛血清后细胞生长状况大大改善，细胞数目增多、生长周期缩短，且成本更低，表明血清对于原代细胞培养至关重要，这与文献报道一致[19-20]。成年小鼠尾尖取材，细胞游出较快，但取材量小，尾部鳞片及毛发较难去除[6]，得到的原代细胞量少、纯度略低；耳部皮肤取材容易，但较难剥离血管、软骨等多余组织，原代细胞纯度低，细胞游出速度慢、数目少、生长周期较长，有文献[7]

采用酶消化法，但操作较为繁琐；成年小鼠背部皮肤取材鲜见文献报道，具有取材量大、细胞纯度高、数量多等优点，是较为理想的取材部位。原代细胞的培养方法常用组织块贴壁法、酶消化法，但各有不足之处，组织块贴壁法培养周期长，易污染，组织块贴壁不牢易脱落[5]。酶消化法由于组织较为致密，难以消化[8]，细胞得率低，且胶原酶的购置成本较高，并不是最为经济的方法[21]。酶消化组织块贴壁法能结合2种方法的优点，酶消化使组织内部细胞变得松散，贴壁更牢，细胞游出更快，大大缩短了培养周期。

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