白介素17在实验性支气管哮喘小鼠气道杯状细胞化生和黏液分泌中的作用

垦匿堕堡盘查！！！！生！旦星；！鲞笙！塑！坐』垦！！已！！！垒Ｐ堕！！！！！！１２１：！！：婪旦：！．论著．白介素１７在实验性支气管哮喘小鼠气道杯状细胞化生和黏液分泌中的作用魏然刘剑波目的观察经鼻滴入白介素１７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１７，ＩＬ－１７）对支气管哮喘（简称哮喘）小鼠气道杯应用免疫组织化学法测定【摘要】状细胞表达Ｍｕｃ５ａｃ黏蛋白的影响．探讨ｌＬ一１７与哮喘黏液分泌的关系。方法正常对照组、哮喘组，ＩＬ一１７组及抗ｌＬ＿１７组肺组织黏蛋白Ｍｕｃ５ａｃ的表达及应用Ａ昏ＰＡＳ染色观察支气管壁杯状细胞数量的差异。结果Ｍｕｃ５ａｃ蛋白阳性表达细胞均主要位于气道上皮。细胞胞浆呈棕黄色。与哮喘组相比，ＩＩ，１７组黏蛋白Ｍｕｃ５ａｃ表达量明显增加（Ｐ＜Ｏ．０１），抗ＩＬ－１７组表达显著减少（Ｐ＜ｏ．０１）。Ａ融ＰＡＳ染色结果同上。结论ＩＬ一１７具有增强哮喘小鼠气道黏液分泌的作用。【关键词】哮喘；小鼠；白介素１７；黏液；杯状细胞ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｔｅｒＩｅｕｋｉｌ卜１７佣ｍｅｔａｐｌ躯ｉａｍｏｕ辩矸，ＥＪｏｆｇｏｂＩｅｔｃｅ¨ａｎｄ鼬ｃｒｅｔｉｏｎｏｆＭｕｃ５ａｃｐｒｏｔｅｉｎｌｎａｊｒｗａｙｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａＩｂｍｎｃｈｉａｌ嬲ｔｈｍａＲ４玎，Ｌ儿，．，如起一幻．眈加以ｍ＃打ｆｏ，ＲＰｓ户ｉｒｎｆｏ删胁ｄ站ｉ挖Ｆ，历ＰＳＦｆｏ刀ｄＡ，，ｉｚ谊把ｄＨｏｓｐｉｆ口Ｚｏ，Ｚ五Ｐ珂ｇｚ＾Ｄ“Ｕ，ｌｉ口Ｐｒ５ｉｆ，，２ｈＰ恕９２虎ｏ“４５００１４，（孺ｉ行口【Ａｂｓｔ糟ｃｔｌｏｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇｉｎｔｒａｎａｓａＵｙｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ＿１７（ＩＬ－１７）ｏｎｇｏｂＩｅｔｃｅｌｌｍｅｔａｐｌａｓｉａｏｆｂｒｏｎｃｈｉａｌａｓｔｈｍａ（ａｓｔｈｍａ）ｍｏｕｓｅａｉｒｗａｙａｎｄｔｈｅｓｅｃｆｅｔｉｏｎｏｆＭｕｃ５ａｃｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓｇｒｏｕｐ，Ｆｏｒｔｙｆｅｍａｌｅａｎｔｉ—ＩＬ一１７ＢＡＬＢ／ｃｍｉｃｅｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｎｏｒｍａｌｃｏｎ”ｏｌｇｒｏｕｐ，ａｓｔｈｍａｇｒｏｕｐ，ＩＬ－１７ｔｅｎｇｒｏｕｐ，ｍｉｃｅｐｅｒｇｒｏｕｐ．Ｍｕｃ５ａｃｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｓｔａｉｎ．Ｒ鹪ｕｌｔｓｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｆｏｒｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆｇｏｂｌｅｔｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｄｂｙｔｈｅＡ降ＰＡＳＭｕｃ５ａｃｐｏｓｉｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｏｆａｉｒｗａｙｅ面ｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｏｆｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ＩＬ一１７ｉｎｃｒｅａｓｅｄｄｅｃｒｅａｓｅｄＭｕｃ５ａｃｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ（Ｐ＜Ｏ．０１），ｗｈｉｌｅａｎｔｉ—ＩＬ，－１７ｇｒｏｕｐｏｂｖｉｏｕｓｌｙＭｕｃ５ａｃｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）．ＡＫＰＡＳｓｔａｉｎｈａｄｔｈｅｓａｍｅｒｅｓｕｌｔｗｉｔｈＭｕｃ５ａｃｐｒｏｔｅｉｎＩＬ－１７ｈａｓｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｅｎｈａｎｃｉｎｇｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ．ＣｏｎｃＩ璐ｉｏ鹏【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｍｕｃ５ａｃｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｓｔｈｍａ；Ｍｏｕｓｅ；Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１７；Ｍｕｃｉｎ；ＧｏｂｌｅｔｃｅＵ目前公认气道杯状细胞异常增生或化生及由此产生的气道黏液高分泌是支气管哮喘（简称哮喘）的重要病理特征［１］，引起的痰液产生、气道狭窄及肺功能急剧下降，成为哮喘高发病率和病死率的重要因素。气道黏液中含有大约２％的黏蛋白，是由位于气道上皮的杯状细胞栅黏膜下层的黏液细胞分泌的·高分子糖蛋白。黏蛋白是黏液基因Ｍｕｃ５ａｃ和Ｍｕｃ５ｂ所编码的基因产物，构成正常人气道分泌物的重要成分。Ｍｕｃ５ａｃ蛋白被认为是支气管杯状细胞分泌的最主要的黏蛋白，Ｍｕｃ５ａｃ基因的过度表达是杯状细胞分泌亢进的主要原因。许多因素如刺激性气体、炎性细胞因子等都可引起气道上皮的黏蛋白分泌异常，导致黏液高分泌。ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４３６Ｘ．２００９．ＯＺ．００５白介素１７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１７，ＩＬ－１７）是近年来发现的一种细胞因子［２］，主要是ＣＤ４＋Ｔ细胞分泌’，在哮喘中起着重要作用，本项目通过翻作小鼠哮喘模型，研究ＩＬ一１７处理及抗体封闭后其气道杯状细胞数量、Ｍｕｃ５ａｃ蛋白表达。探讨ＩＬ－１７对气道黏液分泌的影响与可能的机制，为哮喘气道黏液分泌增多机制提供新的理论依据。可帮助我们寻找新的治疗靶点，为新药的研制提供线索。ｌ材料和方法１．１小鼠分组与哮喘模型建立６周龄清洁级雌性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠４０只（购自郑州大学实验动物中心），体质量（２０±５）ｇ，随机分为正常对照组、哮喘组、ＩＬ一１７组和抗ＩＩ。一１７组，每组１０只。哮喘组、ＩＬ．１７组和抗ＩＩ，１７组每只小鼠均在第１天和第１４天分别腹腔注射ｏ．２ｍｌ含２０弘ｇ卵白蛋白（ｏＶＡ，Ｖ级，美国Ｓｉｇｍａ公司）及２．２５ｍｇ氢氧化铝凝胶的ＰＢＳ溶液各一次进行致敏［３］，然后在第２１天至第３４天（共１４ｄ）将小鼠置于５Ｌ密闭容器中以１％基金项目：河南省自然科学基金项目（５ｌ１０４４３００）作者单位：４５００１４郑州大学第二附属医院呼吸内科万方数据·４００·星堕唑哩盘查！！！！堡！旦笙！！鲞星！塑ｍｉｎ。！！！』垦望巫！：垒２型！！！！！Ｙ！！：！！！丝！：！ＯＶＡＰＢＳ溶液雾化吸人进行激发，每天３０达强度。取其平均值作统计学分析。１．５ＳＰＳＳ其中Ｉ卜１７、抗ＩＬ一１７组于每天激发前１ｈ分别鼻腔滴入重组小鼠ＩＬ—１７，抗重组小鼠ＩＬ一１７（英国ＰｅｒｏＴｅｃｈ统计学方法所有数据以牙±ｓ表示。用１３．ｏ统计软件行方差分析，以Ｐ＜Ｏ．０５为差ＥＣ公司）１肛ｇ加入５０弘ｌＰＢＳ／只［“。正异有统计学意义。２常对照组以ＰＢＳ溶液代替０ＶＡ雾化吸人激发，及鼻腔滴入。１．２肺组织处理于第３４天末次激发２４ｈ后，腹腔注射１０％乌拉坦Ｏ．５ｍｌ麻醉。仰卧固定于手术台，颈动脉放血处死小鼠。分离气管，取出肺组织，然后用一自制钝头注射器插入气管，注入４％多聚甲醛约Ｏ．３ｍ１使肺组织充盈，结扎气管后再浸入４％多聚甲醛中固定，用于免疫组织化学测定。１．３肺组织杯状细胞计数方法肺组织杯状细胞结果哮喘组，ＩＬ一１７组小鼠激发后一周２．１一般情况出现频繁喷嚏，呼吸急促，钻洞，烦躁，毛发竖起，进食减少，体质量减轻。正常对照组，抗１Ｉ。一１７组表现活泼，毛发光泽，无呼吸急促。进食好。２．２病理改变光镜观察：在ＨＥ染色及ＡＢＰＡＳ染色下，正常对照组气管黏膜纤毛柱状上皮细胞问极少有杯状细胞，支气管腔内未见黏液栓形成。哮喘组杯状细胞化生明显，各级气管均可见杯状细胞。ＩＩ。一１７组杯状细胞显著增多，各级气管杯状细胞大量化生，部分管壁上皮细胞几乎全为杯状细胞。支气管黏膜上皮局部剥脱，黏膜下明显水肿，黏膜层、黏膜下层及肌层均有炎性细胞浸润，支气管管腔内分泌物增加。抗ＩＬ一１７组杯状细胞化生较哮喘组明显减轻，各级气管仅见少量的杯状细胞，管腔内未见黏液栓形成，黏膜层、黏膜下层及肌层内浸润成分基本同哮喘组。２．３肺组织杯状细胞计数结果正常对照组ＰＡＳ计数结果光镜下观察。每只小鼠观察５张不同部位的切片，在１００倍放大率下每张切片观察１２个视野的杯细胞总数，其中叶支气管、小支气管、细支气管或终末细支气管各４个视野，计算其平均值。染色后，光镜下观察气道上皮中杯状细胞的存在，杯状细胞阳性ＡＢ—ＰＡＳ染色呈紫红色。每张切片计算杯状细胞总数占气管上皮细胞总数的比例作为平均值进行比较。１．４免疫组织化学法检测肺组织Ｍｕｃ５ａｃ蛋白表达均采用过氧化物酶标记的链酶卵白素（ＳＰ）染色法。即切片经常规脱蜡、水化后，用３％过氧化氢去除内源性氧化酶，微波抗原修复，其余步骤按试剂盒说明书。小鼠抗Ｍｕｃ５ａｃ黏蛋白的单克隆抗体购自深圳晶美生物工程有限公司（美国ＮｅｏＭａｒｃｋｅｒｓ公司生产），ＳＰ试剂盒和二氨基联苯胺显色试剂均购自武汉博士德生物技术有限公司。Ｍｕｃ５ａｃ抗体稀释浓度均为１：１００。阳性判断标准：在高倍视野下，细胞胞浆呈棕黄色染色者为阳性细胞。蛋白表达强度用ＰＩＡ孓１０００高清晰度彩色病理图文报告分析系统（郑州大学病理实验室）测定。每张切片在２００倍光镜下随机选取５个视野测定肺支气管的Ｍｕｃ５ａｃ蛋白光密度表染色，未见杯状细胞，上皮完整，管腔内无黏液（图１）。哮喘组可见较多紫红色的杯状细胞化生，纤毛脱落，正常的纤毛上皮细胞减少（图２）。ＩＩ。一１７组可见杯状细胞显著增多，支气管、叶支气管及小支气管杯状细胞大量化生，部分管壁上皮细胞几乎全为杯状细胞，管腔内有黏液（图３）。抗ＩＬ—１７组仅见少量的杯状细胞，气道上皮完整，管腔内基本无黏液（图４）。具体数值见表１。表ｌＩＬ一１７与抗ＴＩ，１７对杯状细胞数量的影响（彳士ｓ）圈ｌ正常对照组，ＰＡｓ染色．未见杯状细胞．上皮完整．管腔内无黏液ＡＩ｝ＰＡｓ×４００图２哮喘组．可见较多紫红色的杯状细胞化生。纤×４００毛脱落．正常的纤毛上皮细胞减少Ａｌ｝ＰＡｓ图３ｌＩ。一１７组．可见杯状细胞显著增多．支气管、叶支气管及小支气管杯状细胞大量化ｘ生，部分管壁上皮细胞几乎全为杯状细胞．管腔内有黏液ＡＩ｝ＰＡｓ基本无黏液Ａｌ｝ＰＡＳ×４００４００图４抗ｌＬ一１７组．仅见少量的杯状细胞．气道上皮完整，管腔内万方数据垦堕壁堡苤查！！！！生！旦筮！！鲞蔓！塑！！！！曼！！匝！！垒旦型！！！！！∑竺！：！！！塑竺：１２．４小鼠肺组织Ｍｕｃ５ａｃ蛋白表达结果Ｍｕｃ５ａｃ细胞数目明显增加；抗ＩＩ，一１７组肺部病理变化较哮喘组明显减轻，杯状细胞数目明显减少。与正常对照组相比。哮喘组小鼠肺组织Ｍｕｃ５ａｃ蛋白表达增加，１Ｌ一１７组蛋白表达增加更为显著，三者差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５），经抗ＩＬ－１７处理后，肺组织Ｍｕｃ５ａｃ蛋白表达显著减少，少于哮喘组和ＩＬ一１７组（Ｐ值均＜Ｏ．０５），差异有统计学意义，表明ＩＬ－１７可明显增加哮喘小鼠气道黏液分泌。ＩＬ一１７增加Ｍｕｃ５ａｃ黏蛋白的表达的可能原因可能是通过局部ＩＩ，一６的分泌，研究表明ＩＬ—１７能通过多种细胞导致ＩＬ一６的分泌，如激活核因子ＫＢ诱导小鼠成纤维细胞产生ＩＬ一６、刺激人肺成纤维细胞和支气管上皮细胞释放ＩＬ一６，而后者通过ＭＡＰＫ／ＥＲＫ信号通路使得Ｍｕｃ５ａｃ黏蛋白的表达增加［川。蛋白阳性表达细胞主要位于气道上皮。细胞胞浆呈棕黄色。图像分析结果显示，与正常对照组（图５）相比，哮喘组小鼠肺组织Ｍｕｃ５ａｃ蛋白表达增加（图６），ＩＩ。一１７组蛋白表达增加更为显著（图７），三者差异均有统计学意义（Ｐ＜Ｏ。０５），经抗ＩＩ。一１７处理后，肺组织Ｍｕｃ５ａｃ蛋白表达显著减少（图８），少于哮喘组和ＩＬ一１７组（Ｐ值均＜ｏ．０５），差异有统计学意义。具体数值见表２。表２小鼠肺组织Ｍｕｃ５ａｃ蛋白表达结果（ｚ±ｓ）注：与正常对照组比较，“Ｐ＜Ｏ．０５；与哮喘组和ｌＬ—１７组比较，５Ｐ＜０．０５总之，探讨ＩＬ一１７对气道Ｍｕｃ５ａｃ表达的作用，为哮喘气道黏液分泌的控制提供新的思路和理论依据，特异的该通道抑制剂可能为哮喘提供新的治疗策略。参［１］［２］ｊｅｆｆｅｒｙＰＫ，Ｌｉ３讨论生理条件下气道表面分泌适量的黏液，气道黏液能够黏住灰尘、微生物及脱落的细胞，然后纤毛的摆动和咳嗽将其排出呼吸道，作为呼吸道上皮的一层保护性屏障，保持黏膜湿润，防止病原微生物和有害物质的侵袭，是呼吸系统免疫防御的重要机制［５］但在哮喘发病过程中，黏液过度产生和分泌，且难以被清除，造成气道阻塞。气道黏液由黏蛋白基因产生，Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃ５ｂ和Ｍｕｃ５ａｃ是表达气道黏液的三种主要基因，其产物是呼吸道分泌物的主要成分，而Ｍｕｃ５ａｃ代表了哮喘时气道黏蛋白储存量，气道杯状细胞化生的标志Ｌ６］。ＩＬ一１７细胞是一种不同于Ｔｈｌ型Ｔ细胞和Ｔｈ２型Ｔ细胞的、以１卜１７为主要效应因子的新型的辅助型Ｔ细胞。本实验以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠建立哮喘模型，分别使用ＩＬ＿１７和抗ＩＬ－１７对哮喘模型进行处理，观察不同组小鼠肺部的病理改变、肺组织杯状细胞计数和肺组织Ｍｕｃ５ａｃ蛋白表达情况。结果显示，ＩＬ一１７组较哮喘组小鼠肺部病理改变显著，杯状考文献ａｎｄＤ．Ａ；ｒｗａｙｍｕｃｏｓａ：ｓｅｃｒｅｔｏｒｙｃｅｌｌｓ，ｍｕｃｕｓｍｕｃｉｎｇｅｎｅｓ．ＥｕｒＪｅｆｆｅｃｔｏｒＣＤ４ＴＲｃｓｐｉｒ，２００７，１０：１６５５一ｌ６６２．ＰＲ，ｅｔｗｅａｖｅｒｃＴ，ＨａｒｒｉｎｇｔｏｎＩ。Ｅ。ＭａｎｇａｎｃｅＩｌｌｉｎｅａｇｅｗｉｔｈ１ｎｌｍｕｎｉｔｖ，２００６。２４：６７７—６８８．ａ１．Ｔｈｌ７：ａｎＴｃｅｌｌｔｉｅｓ．ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ［３］Ｈｏｆｓｔｒａ（：Ｉ．，ＶａｎＡｒｋＩ，ＨｏｆｍａｎｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＧ。ｅｔａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｔｃｒｆｅｒｏｎ—ｇａｍｍａｏｎａｎｄｅｓｏｇｅｎｏｕｓｉｍｍｕｎｏｇＩｏｂｕＩｉｎｒｅｓｐｉｎｓｉｖｃｎｅｓｓｉｎＣｅｌｌｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃａｍｕｉｎｅｍｏｄｅｌｏｆａｌｌｃｒｇｙａｓｔｈｍａ．ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＳ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＧＰ，ｅｔａｎｄｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎａｎｄａｉｒｗａｙＭｏＩＢｉ０１．１９９８，１９：８２６—８３５．［４］Ｐｒａｕｓｅ（），Ｂｏｚｉｎｏｖｓｋｉａ１．１ｎｃｒｅａｓｅｄｍａｔｒｉｘａｆｔｅｒｍｅｔａ儿ｏｐｍｔｅｉＩｌａｓｅ－９ｗｉｔｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｃｆｉ“ｔｙｓｔｉｍｕＩａｔｉｏｎｊｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１７ｉｎｍｏｕｓｅａｉｒｗａｖｓ．Ｔｈｏｒａｘ，２００４，５９：３１３—３１７．ａ１．Ｍｕｃ－５／５ａｃｉｓａ［５］ＺｕｈｄｉＡｌｉｍａｍＭ，ＰｉａｚｚａＦＭ．ｓｅｌｂｙＤＭ，ｅｌＲＮＡｍｕｃｉｎｍｅｓｓｅｎｇｅｒ９０１）ｌｃｔｃｅｌＪａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍａｒｋｅｒｏｆｍｅｔａｐｌａｓｉａｉｎｍｕ“ｎｅａｉｒｗａｙｓ．ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｅｌｌＭｏｌＢｉ０１．２０００．２２：２５３—２６０．［６］ｓｈｉｚ（）。ＦｉｓｃｈｅｒＭＪ，Ｄｅｓａｎｃｔｉｓ（ｊＴ。ｅｔａ１．１ＦＮ—ｇａｍｍａ，ｂｕｔＦａｓ．ｎｏｔｍｃｄｉ８ｔｅｓｂｙｒｃｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｌｌｃｒｇｅｎ—ｉｎｄｕｃｃｄｍｕｃｏｕｓｃｅＩｌｍｅｔａｐｌａｓｉａ４７７１．ｉｎｄｕｅｊｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊｌｍｍｕｎｏｌ，２００２·１６８：４７６４。ｍｕｃｉｎＩｌ。‘６［７］ＣｈｅｎＹ．ＴｈａｉＰ，ｚｈａｏＹＨ．ｅｔａ１．ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｉｒｗａｙｂｙｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎＢｉｏｌ（ＩＩ。）一１７ｔｈｒｏｕｇｈｐａｒａｃｒｉｎｅ／ａｕｔｏｃｒｉｎｅ１７０４３．ｌｏｏｐ．Ｊ【：ｈｅｍ，２００３，２７８：１７０３６—圈ｓ正常对照组Ｍｕｃ５ａｃ阴性免疫组织化学×４００图６哮喘组小鼠肺组织Ｍｕｃ５ａｃ蛋白表达增加免疫组织化学×４００圈７ＩＩ，１７组Ｍｕｃ５ａｃ染色较哮喘组明显深，范围广免疫组织化学免疫组织化学×４００×４００图８抗ＩＬｌ７组Ｍｕｃ５ａｃ染色明显减少，Ｍｕｃ５ａｃ阳性物质主要位于黏膜表面（收稿日期：２００８一０９—１８）万方数据