肿瘤基因治疗技术

安瑞生,陈晓峰

(中国科学院北京动物研究所,北京100080)

GeneTherapyTechnique

ANRui󰀁sheng,CHENXiao󰀁feng

摘要:肿瘤基因治疗就是将一段特定的遗传信息物质DNA或RNA通过人工方法导入肿瘤细胞以治疗肿瘤性疾病。目前的

研究主要包括三个方面:肿瘤免疫基因治疗、反义RNA、三链DNA。其中研究较多的是肿瘤免疫基因治疗。本文主要对肿瘤免疫基因治疗的构建、接种、应用等方面做了综述,并简要介绍了反义RNA和三链DNA技术。

关键词:基因治疗;基因疫苗;DNA疫苗;反义RNA;三链DNA;肿瘤中图分类号:R730.54文献标识码:B文章编号:1004-0242(2001)10-0577-03

肿瘤免疫基因治疗就是将具有一定功能的外源基因导大肠杆菌内扩增,但不能在哺乳动物细胞内复制

[3]

。通常使

入人体细胞,以补充机体所缺乏的基因或纠正机体异常表达用的质粒载体有PBR322、PUC18、PUC19、PUC118、PUC119的基因。人类基因治疗的探索始于20世纪80年代初,目前等。常用的质粒载体启动子多为来源于病毒基因组的巨细胞已由动物实验向临床试验过渡。本文就肿瘤的基因治疗技术病毒(CMV)早期启动子,具有很强的转录激活作用,带有细的现状综述如下。

菌复制子(ORI),真核生物的启动子和PolyA加尾信号。启动子大多来源于病毒基因组,如CMV、PSV、LTR等,其中以1

肿瘤免疫基因治疗

CMV的转录活性最高,PolyA序列具有保证mRNA在体内的稳定性的作用,这种稳定性因PolyA来源不同而异,目前认为1󰀂1

载体的构建

较好的PolyA来自牛生长激素基因或兔B球蛋白基因。另外,获得合适的抗肿瘤编码基因并将它插入到载体DNA

还可包含一些合适的增强子、终止子、内含子、免疫激活序列上,是发展肿瘤基因治疗的一个主要工作。不言而喻,目的基及多聚腺苷酸信号等。筛选载体可以选用卡那霉素、氨苄青因的选择至关重要。抗肿瘤基因可以是单个基因或具有协同霉素或新霉素等抗性基因。保护功能的一组基因,也可以是编码抗肿瘤基因决定簇的一1.2

目的基因的导入

段核苷酸序列。但是,这都是建立在充分了解病原体基因的主要途径包括间接体内法和直接体内法。间接体内法是基础上的。表达文库免疫技术,提供了一种在各种已知或未指在体外用基因转染肿瘤细胞,然后将经转染的肿瘤细胞输知病原体基因组中获得目的基因的系统而普遍有效的方入病体内,最终给予病体的疗效物质是基因修饰的细胞[4]。法。该技术根据病原体的所有抗原都由其DNA编码这一基直接体内法是指基因片段或完整基因直接注入体内进行治本原理,将病原体基因文库中的病原体DNA片段插入特定疗的办法。就直接体内法而言,目前使用的方法有以下几种:

的质粒中,利用基因免疫的方法筛选病原体基因组中具有免裸DNA直接注射,将裸质粒DNA直接注射到机体的肌疫保护功能的基因片段。目前,基因表达文库免疫技术是发肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内。这种方法简单易行。脂质体包现目的基因的一种最系统、客观的手段。

裹DNA直接注射,包裹DNA的脂质体能与组织细胞发生膜质粒载体必须是能在大肠杆菌中高拷贝地扩增,而在动融合,而将DNA摄入,减少了核酸酶对DNA的破坏。注射途物细胞内则能高效表达,但不复制,也不含有向宿主细胞基径类似裸DNA直接注射[5]

。金包被DNA基因枪轰击法,将质因组内整合的序列。用于基因治疗的载体主要有质粒和病粒DNA包被在金微粒子表面,用基因枪使包被DNA的金微毒,病毒载体曾经被用作抗原基因载体[1],现在主要用质粒粒子高速穿入组织细胞。繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法,选构建载体,由于细菌质粒本身没有很强的免疫原性,这对保择一种容易进入某组织器官的细菌,将其繁殖基因去掉,然证质粒在体内长期稳定地表达有重要意义[2]。

后用质粒DNA转化细菌,当这些细菌进入某组织器官后,由载体一般以PBR322或PUC质粒为基本骨架,它们能在

于能繁殖,则自身裂解而释放出质粒DNA[6]。经改造的mRNA法,将目的基因的mRNA结构进行重组后直接送入体内。

收稿日期:2001-08-22中国肿瘤2001年第10卷第10期

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专

题报道

1.3肿瘤免疫基因治疗的免疫效果

序列,起到了免疫激活作用[12]。未甲基化CpG二核苷酸在原核生物基因组中以一定的频率存在,而在真核生物基因组中较少且被甲基化。基因免疫疫苗CpG寡核苷酸序列在动物体内通过一系列的连锁反应,激活机体的免疫系统,放大抗原的免疫效应。首先,导入个体的疫苗DNA被B细胞、巨噬细胞等抗原提呈细胞内吞进入细胞,质粒中的CpG寡核苷酸序列被细胞识别并导致核因子_󰀁B(NFkappaB)的激活,激活的核因子-󰀁B刺激细胞的基因转录及细胞因子的分泌。其中,B细胞快速分泌白介素_6和IgM抗体,巨噬细胞分泌白介素_12。白介素_12激活自然杀伤细胞分泌󰀂_干扰素,󰀂_干扰素能进一步协助抗原提呈细胞MHC_∃类表面分子提呈疫苗编码的抗原蛋白,激活Th1辅助T细胞的分化、增殖并分泌󰀂_干扰素。在󰀂_干扰素和Th1辅助T细胞的配合下,MHC_#类表面分子提呈疫苗编码的抗原蛋白,激活细胞毒T淋巴细胞成熟分化,导致细胞免疫反应;同时,由白介素-6等细胞因子和Th1辅助T细胞协助,疫苗编码的抗原蛋白激活B细胞成熟分化并分泌抗体IgG2a,而体现一种Th1细胞依赖的由IgM到IgG的抗体类型转换1.5肿瘤免疫基因疫苗优缺点

[14]

[13]

基因治疗肿瘤的动物试验疗效很好,但在临床试验中,仅少数可观察到肯定疗效。其原因可能是:󰀁人体是复杂整体,外源基因进入人体后,尚无法控制其整合与表达;󰀂肿瘤是多基因病,仅仅修正1、2个异常基因,难以将其彻底控制; 人体肿瘤负荷远大于实验动物,治疗难度大;!人体肿瘤多为自发瘤,免疫原性弱,具机体免疫耐受时间长,抗肿瘤免疫难以调动;∀外源基因在人体内的转染效率及表达水平均很低,不能满足治疗肿瘤的需要,当务之急应发展高效、低毒的载体。

1.4肿瘤基因免疫治疗机理

基因免疫能引起多种免疫反应:一是体液免疫反应,在绝大多数基因免疫试验中,都能得到编码蛋白的特异性抗体,抗体主要类型为IgG;二是细胞毒T淋巴细胞免疫反应,基因免疫在抗原提呈细胞内表达的编码蛋白,经过提呈,诱导细胞毒T淋巴细胞产生;三是辅助T细胞反应,基因免疫能激发辅助T细胞的增殖,并伴有细胞因子的分泌,主要的细胞因子为白介素_12和干扰素,属典型的Th1型辅助T细胞反应。还有些试验还发现,基因免疫还有辅助T细胞参与的免疫记忆效应。

基因免疫的详细机理目前尚不十分清楚。但是一些研究已搞清了基因免疫反应机制的两个主要问题。第一是关于肌肉注射的问题。基因免疫采用肌肉注射的方法能激发强烈的体液免疫反应和细胞免疫反应,这可能与其自身的结构有关。目前已确定的是,经过肌肉组织的树突状细胞带走了肿瘤免疫疫苗并产生了抗原。树突状细胞是体内专职的抗原提呈细胞,负责将细胞内的异源物质提呈给免疫系统。少量的树突状细胞内吞了肿瘤免疫疫苗DNA,表达后可激活所有的树突状细胞,进而激发强烈的免疫反应[9]。一些以前的研究包括:Wolff等[10]认为,肌细胞通过T小管和细胞膜穴样内陷把外源基因纳入并表达相应的抗原蛋白,后者被降解为8~12个氨基酸小肽,包含不同的抗原表位。来源于胞液和囊液的抗原表位分别与MHC_#类分子和MHC_∃类分子结合,被呈递到细胞表面,分别激活CD8+T细胞(CTL)和CD+4T细胞(炎性T细胞和辅助T细胞);而分泌到细胞外的抗原则被带有相应抗体的B细胞捕捉,在Th细胞的作用下转化为浆细胞产生抗体;Vahlsing等认为,肌细胞可能作为一种中心成分直接参与免疫应答;另一种观点是,肌细胞的直接参与并非必需,NP被分泌出来后被巨噬细胞和(或)树突样细胞吞噬、处理、提呈,分别在MHC_#类和MHC_∃类分子的限制下,诱导CTL前体、B细胞和特异性Th细胞;还有一种解释是,DNA免疫时,肌细胞和APC均被转染,引起CD4+、CD8+T细胞亚群同时活化,产生特异性免疫应答。不管是哪一种途径均可诱导机体的应答,特别是更有效的细胞应答。第二,基因免疫在动物体内产生微量的抗原蛋白所诱发的机体免疫应答效果可以同活疫苗相比,而用等量的抗原蛋白直接免疫动物根本不能诱发任何免疫应答。其原因就在于用作载体的细菌质粒DNA中带有一定数量的CpG寡核苷酸

[12]

[11][8]

[7]

。

抗原基因在体内持续表达产生抗原,不断刺激机体免疫系统产生长程免疫,免疫效果更可靠。对于易变异的病毒,可以选择各亚型共有的核心蛋白保守DNA序列作基因疫苗,产生跨株系的免疫保护反应,从而避免易变异病毒产生的免疫逃避问题。一个质粒可插入多个抗原基因,即组成多价基因疫苗,故一种基因疫苗可免疫多种疾病。基因疫苗具有减毒活疫苗的免疫原性,但不会存在活疫苗的毒力回升的危险。基因疫苗的质粒DNA无免疫原性,不会像重组疫苗那样诱发针对载体的自身免疫反应,故可重复使用。另外,基因还不会受机体已有抗体的影响,可用于带母体抗体的婴儿。对于毒性大、危险的病毒,以及难以提取抗原的疫苗,基因疫苗的制备相对安全,容易得多。基因疫苗制备简单,容易大量生产,且成本低。质粒DNA非常稳定,易于贮存和运输。使用方便,可以经多种途径给药,不需免疫佐剂等。

另一方面基因疫苗作为一类新型疫苗,还有一些方面不完善,在实际应用中还存在一些问题有待解决:安全性问题,基因疫苗一般不会整合到染色体基因组上,但不能排除少数质粒DNA插入到染色体上,引起插入突变的可能性。不过目前的动物实验尚未发现发生插入突变的证据。免疫效率有种属个体差异,各动物之间的免疫效率不一样,这可能与不同动物细胞需要不同启动子有关。同种动物之间也有个体差异,免疫效率往往不能达到百分之百,这可能与抗原基因、给药方法途径、给药量有关。基因疫苗体内持续表达产生抗原蛋白,可能引发免疫耐受。以上不足之处给基因疫苗的研究工作提出了新的课题。

专题报道

2反义RNA

反义RNA指与mRNA互补后,能抑制与肿瘤发生直接

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相关基因的表达的RNA。它封闭基因表达,具有特异性强、操基因免疫的免疫力已被人们所公认,但其免疫机制不甚作简单的特点,可用来治疗由基因突变或过度表达导致的肿了解,所以目前对基因免疫机制的研究,主要是构建高效免瘤疾病。反义RNA治疗的基本方法有:

疫效力的基因疫苗。

A反义寡核苷酸:体外合成十至几十个核苷酸的反义基因治疗的安全性问题即载体DNA的自身免疫问题,

寡核苷酸或反义硫代磷酸酯寡核苷酸序列,用脂质体等将反有关的报道比较少,因此建议该方法首先用于动物治疗。

义寡核苷酸导入体内靶细胞,然后反义寡核苷酸与相应基因免疫在体内表达的微量抗原蛋白能够激发个体的mRNA特异性结合,从而阻断mRNA的翻译。

免疫反应,但很多情况下强度很弱,一方面是由于基因免疫B

反义RNA表达载体:合成或PCR扩增获取反义

的转化效率有限,同时也因为基因免疫疫苗在宿主体内不能RNA的DNA,将它克隆到表达载体,然后将表达载体用脂质像活疫苗那样自我复制。因此寻找合适的免疫佐剂是增强基体导入靶细胞,该DNA转录反义RNA,反义RNA即与相应的因免疫活性的重要手段。

mRNA特异性结合,同样阻断某基因的翻译。

反义RNA的特点:反义RNA用于基因治疗具有特异性参考文献:

强,只阻断靶基因的翻译表达,反义RNA只与特定mRNA结合,不改变基因结构,最终会被RNase水解,不残留。适应于[1]

Tanghe多种疾病,亦可同时用多个反义RNA封闭多个基因,有可能and应用于多基因病。但是,反义RNA的选择设计难,反义RNAcodingprotectiveA,Lefevremunol,putativeefficacyP,phosphateofDenisO,etal.ImmunogenicitytransporttuberculosisreceptorsDNAvaccines[J].en󰀁与mRNA亲和力、结合的特异性受结合位点两侧序列的二级[2]

Montgomery1999,ous或三级结构的影响较大。

DNAandhomoloDL,162(Shiver2):1113-JIm󰀁gouspJW,1119.

rotectionLeanderaKR,etal.Heterolog_andGilCellvaccination:BiolooptimizationofDNAgainstvectorsinfluenza[J].ADNAby[3]gy,1993,12(9):777-3三链DNA

ducedCastrocellsIL_2A,isSilvareRA,A783.

quiredforpptheelbergR.Endogenouslypro󰀁The脱氧寡核苷酸能与双螺旋双链DNA专一性序列结合,[4]LaiJournaldurininductionofgmofycobacteriumImmunoloaviuminfectionsinprotectivemice[J]T.gy,1995,155(4):inWC,BennettN.DNAvaccines[J].Critical2013-Reviews2019.形成三链DNA来阻止基因转录或DNA复制,为了与作用在[5]

GramzinskiImmunology,mRNA翻译水平的反义RNA的反义技术相区别,将三链DNAtoRA,1998,Millan18(CL,5):Obaldia449-484.

N.ImmuneparisonahepatitisBDNAvaccineinaotusmonkeys:responseacom󰀁技术称之为反基因技术。

ministrationofvaccine基本方法与机理:设计合成15~40个碱基的脱氧寡核[6]

Schirmbeck[J].formulation,route,andmethodofad󰀁vaccination苷酸,这些序列具有较短而兼并性较高的特点,与双链DNAc结合,通常结合在蛋白识别位点处,形成三链DNA,干扰DNAroltotoxicTpR,lrimesBMoloehmMed,mhepatitisW,1998,4(2):109-118.

BAndovirusK,surfaceetal.antiNucleicacidphocytesinnonrespondermice[genJ]_s.pJecificyy[7]Davis,1995,与蛋白质的结合,如转录激活因子,从而阻止基因的转录与复制。

[8]

ooseofHL.69(immunizationPlasmid10):Vi󰀁DNA5929-[J].ex5934.

CurrentpressionOspyinionstemsinforBiotechnolthepur󰀁p󰀁Tutinggy,1997,T,Wilson8(5):CC,635-Martin640.

DM,et三链DNA所需剂量小,因为它是针对转录水平的DNAmonocyte_序列,并且具有较强的特异性,因为1~2个碱基的错配将导expressresponsesmelanomaderiveddendritical.Autologoushumanantigenscellsgeneticallymodifiedto致三链DNA稳定性大大降低。但是三链DNA稳定性不够,半genesinvitro:EnhancemelicitentprimarybycotransfectioncytotoxicTcellof衰期较短。而且它必经与同聚嘌呤同聚嘧啶片段结合,但这[9]

HoIFN_样DNA片段在真核细胞很少。

inducesTY,alphaencodingHsiang[J].JtheCY,ImmunolTh1_biasingcytokinesIL_12andHsiang,1998,CH,160(et3):1139-1147.munitrolyaagainstlong_ptermseudorabiesantibodyvirusresponseal.inmiceandDNA[protectivevaccinationJ].ArchimVi󰀁4肿瘤基因治疗的应用

[10]

Wolff,1998,TlasmidsJA,143(bDowt1):115-Jiao125.

󰀁yME,S,etal.Expressionofnakedpycultured[随着对肿瘤的研究在分子水平上取得突破性进展,肿瘤

[11]VahlsingJ]tubules.JCellandmyotubesandentryofplasmidsintoSci,caveolae1992,103(of4)mammalianskeletalmuscle的基因治疗已成为当前研究的热点。肿瘤细胞常常会有多种ationmunolwithHL,YankauckasMA,Sawdey:1249-M,1259.

etal.Immuniz_基因的改变,因此,目前将一些涉及肿瘤的主要基因进行基[12]KlinmanMethodsplasmid,DNAusingapneumaticgun[J].JIm_因治疗,如p53抑癌基因、ras癌基因等。p53基因是至今发现butionDM,Yamshchikov1994,175(G,1):Ishigatsubo11-12.

Y,etal.cinesofCpGmotifstotheimmunogenicityofDNAContrivac󰀁_与人类肿瘤相关性最高的基因,约50%的人类恶性肿瘤中都[13]

Yi存在p53基因的异常。因此在基因治疗的研究中p53基因的terialAK,[J]DNATuetken.Immunol,1997,158(8):3635-3639.

activateR,RedfordleukocT,etal.CpGMotifsinbac󰀁地位十分突出。另外,由于外源遗传物质可能影响生物的群1998,ofreacteveoxygenytessthroupeciesgh[theJ]PH.J_degenerationImmunolpendent,体遗传特征,因此,目前的基因治疗主要限于生物的体细胞,[14]

Akbari160(transfectionO,Pan10):4755-4761.

而生殖细胞和受精卵则禁止使用。

forimmunitandjwaniactivationN,Garcia.JExofdendriticS,etal.cellsDNA169.

asvaccination:keyeventsy[J]pMed,1999,189:中国肿瘤2001年第10卷第10期

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题报道