一株耐高温乳酸菌的发酵条件优化

食品研究与开发　２０１２年５月　生物工程　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｎｄ　ＤｅｖｅｌｏＤｍｅｎｔ　第３３卷第５期　１６１＝＝＝・　一株耐高温乳酸菌的发酵条件优化　王玉－，吴疆　。吴家鑫　（１．天津农学院农学系，天津３００３８４；２．中牧实业股份有限公司兽药研究所，北京１０００９１）　摘要：选用乳酸菌发酵生产Ｌ－乳酸，利用ＳＡＳ软件的Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计和Ｂｏｘ—Ｂｅｎｈｎｋｅｎ设计优化了发酵培养　基，以期提高Ｌ－乳酸的产量。最终确定最优培养基为（ｇ／Ｌ），乙酸钠１．６９、蛋白胨６．３３、酵母膏６．６３、葡萄糖３０、吐温８０　１、　玉米浆１０、柠檬酸二铵２、ＫＨ：ＰＯ　０．２８、ＭｎＳＯ４・７ＨｚＯ　０．２、ＭｇＳ０４＂７ＨｚＯ　０．２、ＣａＣＯ３　１０。在上述条件下，发酵乳酸菌的　Ｌ－乳酸产量为１２．５３３　ｇ／Ｌ，比优化前提高７４．０７％。　关键词：Ｌ一乳酸；响应面分析；培养基优化　Ｔｈｅ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ　ａｔ　Ｈｉｇｈ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ＷＡＮＧ　Ｙｕ　，ＷＵ　Ｊｉａｎｇ。，ＷＵ　Ｊｉａ－ｘｉｎ　（１．Ｄｅｐａ￣ｍｅｎｔ　ｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００３８４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｄｒｕｇ，Ｃｈｉｎａ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００９１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｌ－ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　Ｐｌａｃｋｅｔｔ——Ｂｕｒｍａｎ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ　ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ＳＡＳ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗａｓ（ｇ／Ｌ），ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　１．６９，ｐｅｐｔｏｎｅ　６．３３，ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　６．６３，ｇｌｕｃｏｓｅ　３０，ｔｗｅｅｎ　８０　１，ｃｏｌｎ　ｓｌｕｒｒｙ　１０，ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ　２，ＫＨ２Ｐ０４　０．２８，ＭｎＳＯ４＂７Ｈ２０　０．２，ＭｇＳＯ４＂７Ｈ２０　０．２，ＣａＣＯ３　１０．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　Ｌ－ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｗａｓ　１２．５３３　ｇ／Ｌ．ｗｉｔｈ　ａ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　７４．０７％．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｌ－ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ；ｍｅｄｉｕｍ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，是重要的　自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；生　生物化工产品，在医药、食品等工业有广泛的应用口ｌ。　化培养箱（５５℃）：江苏金坛市宏凯仪器厂；电热恒温　它也是制造无毒的高分子化合物聚Ｌ一乳酸的单体，且　鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；电子天平：　聚Ｌ一乳酸具有良好的生物相容性，强度高，可塑性加　梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司；旋转式恒温调速　工成型，不污染环境因而被认为是最有前途的可生物　摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司；超净工作台：　降解高分子材料　。在乳酸发酵工业中，利用高温乳酸　苏州安泰空气技术有限公司；生物传感分析仪ＳＢＡ一　菌可以缩短生产周期、节约冷却用水，减少污染的可　４０Ｃ：山东省科学院。　能性。　１．２耐高温乳酸菌ＬＡ一５５　本文将Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计与Ｂｏｘ—Ｂｅｎｈｎｋｅｎ设　由天津农学院微生物实验室筛选保藏。　计相结合，并运用ＳＡＳ软件对一株能够耐受５５℃高温　１－３培养基　的乳酸菌发酵乳酸的培养基进行了优化。　斜面培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖５０、蛋白胨１０、酵母膏　５、牛肉膏１０、乙酸钠５、ＭｇＳＯ４・２Ｈ２Ｏ　０．２、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ　１仪器、材料与方法　０．０３８、柠檬酸二胺２、Ｋ２ＨＰＯ４２、ＣａＣＯ３　１７，ｐＨ６．５。　１．１仪器　种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖３０、蛋白胨１０、酵母膏　飞鸽牌系列离心机：上海安亭科学仪器厂；座式　１０、牛肉膏１０、乙酸钠５、ＭｇＳＯ４・２Ｈ２Ｏ　０．２、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ　基金项目：天津农学院科技发展计划项目２００７００６　０．２、柠檬酸二胺２、Ｋ２ＨＰＯ４　０．２、ＣａＣＯ３　２０、吐温８０　１，　作者简介：王玉（１９８Ｏ一），女（汉），讲师，硕士研究生，从事微生物学、　ｐＨ６．８。　生物制药的教学和科研工作。　发酵培养基：初始发酵培养基同种子培养基，在　ｌ６２　王玉，等：一株耐高温乳酸茵的发酵条件优化　生物工程　优化实验中，各成分的量随设计的不同而不同。　１．４实验方法　１．４．１　Ｌ一乳酸的发酵　将斜面３　环接于装有５０　ｍＬ种子培养基的２５０　ｍＬ　三角瓶中，５５℃下１２０ｄｒａｉｎ培养１２　ｈ即为种子液。以　１０％（体积比）的接种量接种于装５０　ｍＬ发酵培养基　的２５０　ｍＬ三角瓶中，５５℃，１２０　ｒ／ｍｉｎ摇床培养３６　ｈ。　发酵培养基成分根据实验方案逐次改变。　１．４．２分析方法　采用生物传感分析仪。　１．４－３　Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计　采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计可以在多种因素存在　的条件下评价各因素之间的相对重要性Ｉ３＿。选用实验　次数Ｎ＝１２的实验设计，对９个因素进行考察，各因素　对应的水平取值见表１。　表１　Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计因素水平表　Ｔａｂｌｅ　１　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｒｎａｎ　ｄｅｓｉｇｎ　ｇ几　１．４．４　Ｂｏｘ—Ｂｅｎｈｎｋｅｎ设计　Ｂｏｘ—Ｂｅｎｈｎｋｅｎ中心组合设计是比较常用的响应　面分析法（ＲＳＡ）方法，适用于２至５个因素的优化实　验　。本实验在Ｐ—Ｂ实验的基础上，以乙酸钠，酵母膏，　蛋白胨３个因素为自变量，设计了三因素三水平响应　面分析实验。各自变量的编码值如表２所示。　表２　Ｂｏｘ—Ｂｅｎｈｎｋｅｎ设计因素水平编码表　Ｔａｂｌｅ　２　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ　ｄｅｓｉｇｎ　ｇ几　２结果与分析　２．１　Ｌ一乳酸发酵主要影响因素的确定　采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验对前期实验筛选出的　氮源、碳源和无机盐进行优化，选出对Ｌ一乳酸发酵有　重要影响的因素，实验方案及结果见表３。　表３　Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计及结果　Ｔａｂｌｅ　３　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ　ｄｅｓｉｇｎ　配方Ａ　Ｂ　Ｃ（Ｄ）Ｅ　Ｆ　Ｇ（Ｈ）Ｉ　Ｊ　Ｋ　Ｙ／（ｇ／Ｌ）　１　－１　１　１　一ｌ　ｌ　一１一ｌ一１　１　ｌ　１　１２．３３２　２　１　—１　１　１　—１　１　—１一ｌ－１　１　１　３．０８３　３　－１—１　１　１　１　—１　１　ｌ　－１　１　—１　８．４７８　４　１　１　１　—１　１　１　—１　ｌ　一１一ｌ一１　９．２４９　５　１　１　一ｌ　１　—１—１一ｌ　１　１　１　—１　２　３１２　６　—１　１　１　１　一ｌ　１　１　一ｌ　ｌ　一１—１　７．７０８　７　—１－１—１－１一ｌ一１一ｌ一１—１—１－１　０．７７１　８　—１－１—１　１　１　１　一ｌ　ｌ　ｌ　—ｌ　１　２．５７４　９　１　－１　１　—１—１—１　１　１　ｌ　一１　１　２．５ｌ３　１０　—１　１　—１—１—１　１　ｌ　１　—１　１　１　２　５７４　ｌ１　１　１　—１　１　ｌ　一１　１　—１—１一ｌ　１　ｌ０．５２８　１２　１　—１—１—１　１　１　ｌ　一１　ｌ　ｌ　一１　６．１６６　通过ＳＡＳ软件对实验结果进行分析，各因素主效　应分析结果见表４。　表４各因素的主效应　Ｔａｂｌｅ　４　Ｍａｉｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆａｃｔ０ｒｓ　注：“　表示显著。　乙酸钠在仅＝０．１水平上对Ｌ一乳酸产量有显著影　响，其他因素均不显著。综合实验分析，选择排在前三　位的乙酸钠、酵母膏、蛋白胨进行下一步实验。　２．２最适灰树花胞外多糖发酵培养基的确定　２．２．１　Ｂｏｘ—Ｂｅｎｈｎｋｅｎ实验设计及分析　依据Ｐ—Ｂ实验和最陡爬坡实验确定的实验因素　与水平，采用Ｂｏｘ—Ｂｅｎｈｎｋｅｎ实验设计对产灰树花发　酵条件进行三因素三水平的响应面分析实验，实验结　果见表５。　运用ＳＡＳ软件的ＲＳＲＥＧ（响应面回归）过程对数　据进行二次回归拟合见表６、表７。由表６可知，该回归　模型显著，复相关系数的平方Ｒ　＝０．９２１　０，因此通过　ＳＡＳ软件分析得出的此回归方程拟合程度较好。方差　分析说明，各因素的一次项、二次项显著影响Ｌ一乳酸　合成，说明响应面分析所选的３个因素（乙酸钠、酵母　膏、蛋白胨）主效应显著。失拟检验Ｐｒ＝Ｏ．５０３　８，不显　—＝＝＝１６４　王玉，等：一株耐高温乳酸菌的发酵条件优化　参考文献：　生物工程　好的预测实际发酵情况。从而，确定最适发酵培养基　（ｇ／Ｌ）：乙酸钠１．６９ｇ／Ｌ、酵母膏６．６３　ｇ／Ｌ、蛋白胨６．３３　ｇ／Ｌ。　比最初的产量７．２　ｇ／Ｌ提高了７４．０７％，表明该模型是　［１］ＡＢＤＵＬＬＡＴＩＦ　Ｔ，Ｓｈａｎｇ－ｔｉａｎ　Ｙａｎｇ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌ—ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｆｒｏｍ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　Ｓｔａｒｃｈ　ｂｙ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｃ　ｉｎ　ａ　合适有效的，并具有一定的实践指导意义。　３结论　ｒｏｔａｔｉｎｇ　ｉｆｂｒｏｕｓ　ｂｅｄ　ｂｉｏｒｅａｃｔｏｕ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　２００２．８０（１　ｏ１：ｌ—ｌ２　［２】徐忠，汪群慧，姜兆华．Ｌ一乳酸的制备及其应用的研究进展　化　学与粘合，２００４，２１４（４）：２１４—２１７　通过ＳＡＳ软件优化发酵培养基，通过Ｐｌａｅｋｅｔｔ—　Ｂｕｒｍａｎ实验得出乙酸钠、酵母膏、蛋白胨为影响乳酸　产量的显著因素；再经过响应面分析实验得出最优培　养基配方：乙酸钠１．６９　ｇ／Ｌ、酵母膏６．６３　ｇ／Ｌ、蛋白胨　［３］疏秀林施庆珊，冯静等　聚谷氨酸发酵培养基的Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ　法优化［Ｊ］．生物技术通报，２００７（４）：１７３—１７７　Ｉ４】Ｂａｒｒｙ　Ｄ　Ｇｒｅｉｇ，Ｇｅｒａｌｄ　Ａ　Ｐａｙｎｅ．Ｅｐｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌａｃｔｏｓｅ　ｔｏ　ｆｒｅｅ　ｌａｃ—　ｔｕｌｏｓｅ　ｉｎ　ｈｅａｔｅｄ　ｍｏｄｅｓ　ｍｉｌｋ　ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｄａｉｒｙ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，　６．３３　ｇ／Ｌ，使Ｌ－乳酸产量在５５℃条件下由初始发酵条件　下的７．２　ｇ／Ｌ提高到１２．５３３　ｇ／Ｌ，提高百分比为７４．０７％，　优化结果非常显著。　１９８５，５２（３）：４０９—４１７　收稿日期：２０１１－０９—３１　◆●●●◆　●●●●◆●●◆◆◆◆◆●●●●◆●◆●●　●●・●●●◆　（上接第１４８页）　差异：前者含量最高的是杂环类化合物（４７．１６％），其　次分别是有机酸类（１９．３３％）和酯类（１７．１９％）；后者　乙酸乙酯部位的含量仅为２４．２３％。酯类化合物、杂环　和芳香类化合物均是酒中重要的呈香物质　，由此可　以看出蜜源生物液比紫云蜜更适合作为添加剂应用　于酿酒业中。　参考文献：　［１］Ｎｏ—Ｓｅｏｎｇ　Ｋ，Ｄａｖｉｄ　Ｊ　Ｊ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｆｏｏｄｓ　Ｐａｒｔ　ｈ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｆ　ｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｐｔ　Ｉ　Ｊ１．Ｆｏｏｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ，２００１，１２（２）：９９－１０７　含量最高的是有机酸类（３３．９３％），其次是杂环类化合　物（１８．１７％）。纵观表１还可以看出５一羟甲基一２一呋喃　甲醛是蜜源生物液乙酸乙酯部位中含量最高的，达　４１．９２％，而该物质在紫云蜜乙酸乙酯部位中仅有　ｌ７．７６％。至于这些差异对蜜源生物液的特殊功效是否　有关，还有待于进一步的研究。　４）从表１可以看出蜜源生物液和紫云蜜乙酸乙酯　部位均有酚类物质的存在。相关研究已经表明酚类物　质是很强的体外抗氧化剂，可以有效清除机体内可以　导致心血管疾病的自由基，减轻和消除机体内氧化应　激Ｉ３　。这提示蜜源生物液所具备的抗氧化活性与该类　［２］丛蒲珠，李笋玉．天然有机质谱学［Ｍ］．北京：中国医药科技出版　社　２００３：１４—１６　［３】Ｓｕｎ　Ａ　Ｙ，Ｓｉｍｏｎｙｉ　Ａ，Ｓｕｎ　Ｇ　Ｙ．Ｔｈｅ‘Ｆｒｅｎｃｈ　ｐａｒａｄｏｘ’ａｎｄ　ｂｅｙｏｎｄ：　ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ［Ｊ］．Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃ　Ｂｉｏ　Ｍｅｄ，２００２，　３２ｒ４１：３１４—３１８　【４】徐坤，任红蕾．不同种类蜂蜜的抗氧化作用研究［ＪＪ＿食品工业，　２００８（５）：５４　物质有关，但具体的量效关系还有待研究和探索。至　于本次检测　的其他成分对抗氧化活性是否有贡献　还需考证。　［５］王贵庆，杨敏．酯类物质对啤酒质量的影ｔｌｌ￣［Ｊ］．食品安全导刊，　２００９（２）：８８　『６　李家寿．６］黄酒色、香、味成分来源浅析ｌｊ１．酿酒科技，２００１（３）：４８—　５Ｏ　５）通过对比发现：（１）酯类、醇类、醛类在蜜源生物　液乙酸乙酯部位中的总相对含量为２０．２６％，而这３类　［７］罗涛，范文来，郭翔，等．顶空固相微萃Ｉ￣（ＨＳ—ＳＰＭＥ），￣Ｉ气相色谱　一化合物在紫云蜜乙酸乙酯部位的含量仅为１３．６６％。　（２）杂环和芳香类化合物在蜜源生物液乙酸乙酯部位　中的总相对含量为４９．４９％，而该类化合物在紫云蜜　质谱（ＧＣ—ＭＳ）Ｎ＝Ｊ＝分析黄酒中挥发性和半挥发性微量成分　．　酿酒科技，２００７（６）：１２１—１２４　收稿日期：２０１１—１１—１２