环介导等温扩增技术检测稻香基因OsBADH2编辑后代纯合材料的研究

环介导等温扩增技术检测稻香基因OsBADH2

编辑后代纯合材料的研究

周　岩1,2　　管翊君3　　魏　健1,3　　王　萌1　　沈彦岐1　　李毅丹2

（1.长春师范大学，吉林　长春　130000；2.吉林省农业科学院，吉林　长春　130000；3.吉林农业大学，吉林　长春 130000）

摘　要：作物基因编辑后代材料的检测是基因编辑育种研究中的重要一环，现有检测方法无法高效的鉴别基因编辑

产生的纯合材料。为解决这一问题，研究通过环介导等温扩增技术对稻香相关基因OsBADH2编辑的T1代吉粳88纯合突变材料进行检测研究。结果表明，在LAMP扩增反应中引入红色荧光背景250 mmol HNB能够可视化的鉴定出纯合的T1代吉粳88突变体。

关键词：环介导等温扩增；基因编辑检测；可视化荧光染料文章编号：ISSN2096-0743/2019-27-0094

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术是一种对生物体自身基因进行编辑的技术，该技术构建载体简单，编辑效率高，成本低，目前在动植物基因的靶向修饰中均具有大量研究。在CRISPR/Cas9介导的作物育种研究中，其后代材料数量庞大，需要进行大量的检测鉴别。刘春霞等人总结了近年来科学家们对基因编辑后代材料的检测方法，这些方法虽然精准，但仍需大量的人力物力。建立一套不依赖核酸扩增仪，通量高的检测方法具有重要的研究价值。

环介导的等温扩增技术（loop mediated isothermal 重复浸提试验，已确定单位体积萃取液的最优利用率。参考文献：

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基金项目：陕西省土地工程建设集团内部科研项目“渭东新城砷污染土壤淋洗修复技术研究”（DJNY 2019-17）

作者简介：闫波（1990—），男，山东德州人，硕士，工程师。主要从事污损土地修复技术研究

amplification , LAMP）是一种具有潜力的核酸分子定性检测技术，该技术凭借其反应时间短、检测灵敏、且不依赖核酸扩增仪等检测设备而被广泛的应用在食源性致病微生物以及植物转基因成分的检测中。基于CRISPR/Cas技术最终以非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）机制修复双链，引入错配，使靶位点的核酸序列发生改变的原理，将LAMP扩增引物的F3端或B3端设置与编辑靶点重叠，当靶点发生编辑后LAMP引物无法识别靶位点，不能进行有效扩增而呈现阴性反应，而未发生编辑的样品能of soil contamination for exposure of children[J]. Environment Research， 2007

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实验研究

够迅速扩增。可视化是等温扩增的研究趋势，在扩增体系中加入荧光染料EvaGreen以及背景荧光染料羟基柰酚蓝（HNB）能够使LAMP检测结果可视化。在反应初期，由于双链DNA浓度低荧光染料EvaGreen未能嵌入DNA小沟，因而在蓝光激发下产生较弱的绿色荧光，当红色荧光物质HNB存在时，微弱的绿色荧光被遮盖，表现为橘红色荧光。95

LT-BIP-2LT-F3-3LT-B3-3LT-FIP-3CTGGCTGCTGGCTGTACAG-GCTCCAAACAAGT-CACGGA

TGCACCTGTCTCTCTTCCAACCTGAAGGAAGACCAACCTC

CCATGTTGCCATCAGGA-CTTCGGAAAGAG-CCTATCGGACCTTCCATGTTGCCATCAGGA-CTTCGGAAA-随LAMP扩增反应的进行，染料EvaGreen嵌入双链DNA的比例增加，绿色荧光信号增强，反应结束后，扩增阳性样品表现为橘黄色荧光。探寻一种合适的荧光染料配比能够使LAMP检测可视化，将这种可视化的LAMP反应应用在基因编辑后代材料的检测上能够高效，简便，快速的鉴定出位点发生纯合编辑的突变体材料。

1.材料方法1.1材料

由吉林省农业科学院生物技术研究所提供的稻香相关基因OsBADH2编辑的T1代吉粳88，以及野生型吉粳88。

试剂

2× Phanta Max Master mix（p515, vayzme），Bst DNA聚合酶（#M0328V, NEB）。

1.2方法

1.2.1基因编辑材料靶位点的序列验证及LAMP检测引物的筛选

使用OsBADH2靶位点测序引物CX1（见表1）扩增3份OsBADH2编辑的T1代吉粳88，以及1份野生型吉粳88。PCR反应体系为：2× Phanta Max Master mix 12.5 μL；上下游引物各0.5 μL；DNA模板1 μL；水10.5μL。PCR反应程序为：95 ℃2 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，共40个循环；72 ℃ 10min。将扩增后的样品送至吉林省库美生物公司进行测序分析。

表1　引物信息

引物名称引物序列

Primer namePrimer sequence (5’-3’)LT-F3-1TGCACCTGTCTCTCTTCCAALT-B3-1CCTGAAGGAAGACCAACCTC

LT-FIP-1ACCTTCCATGTTGCCATCAGGA-CTTCGGAAA-GAGCCTATCGGLT-BIP-1CCTGGCTGCTGGCTGTACAG-GCTCCAAACAAGT-CACGGAA

LT-F3-2CGTTTTGCACCTGTCTCTCTTCLT-B3-2TGAAGGAAGACCAACCTCTTTA

LT-FIP-2

ACCTTCCATGTTGCCATCAGGA-CTTCGGAAA-GAGCCTATC

LT-BIP-3GAGCCTATC

CXR1GTGCTTGACATTGGGGAGTTCXF1

ACATTGTTGGAGCCGAAATC

通过LAMP引物在线设计网站PrimerExplorer（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）设计基因编辑靶位点的检测引物，并保证LAMP扩增引物的F3或B3与基因编辑的靶位点有15bp的重合。最终设计了3组引物（表1）。荧光LAMP反应体系：0.8UbstDNA聚合酶1μL；引物40nmol F3/B3 各1μL；引物5nmol FIP/BIP各1μL；；100mmol Mg2+ 1.5μL；10×Isothermal Amplification Buffer 2.5μL；EvaGreen 1μL；ddH20 14μL；DNA 1μL；荧光LAMP反应程序为：65 ℃2 min；65 ℃ 40 s，65 ℃ 10 s，共40个循环。

1.2.2可视化LAMP特异性检验

以T1代吉粳88位点编辑材料LT-1,LT-2,LLT-3的DNA为阴性样品，野生型吉粳88的DNA为阳性样品，DNA浓度均稀释为30ng.L-1。进行LAMP特异性可视化检验，在荧光LAMP反应体系的基础上加入270mmol的红色荧光染料HNB 1μL制成样品M-a，加入250mmol HNB1μL制成M-b ，记录反应前荧光颜色，65 ℃条件下反应20min，再次记录荧光颜色。

2.结果

2.1吉粳88样品材料OsBADH2靶位点测序结果 对4份吉粳88材料靶位点进行PCR产物测序，测序结果表明，测序峰为单一峰，LT-A,LT-B,LT-C的OsBADH2基因编辑靶点均产生了1bp缺失的纯合突变（图1）。

图1. OsBADH2靶位点测序分析2.2 LAMP检测

以野生型吉粳88的基因组DNA为材料进行了荧光LAMP分析，扩增结果表明LAMP稻香基因OsBADH2靶点检测引物LT1扩增效率较高，17min内可以完成整个扩

·95·

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增反应，检出信号高于另外两组引物引物（图2）。

图2 基因编辑靶点LAMP扩增引物筛选

在LAMP反应体系中加入HNB红色背景荧光，用

于可视化区分LAMP反应结果。结果显示，270nmol与250nmolHNB的加入相对单一的EvaGreen均能明显的区分阴性与阳性检测结果。其中M-a红色背景荧光信号较强，反应前后的颜色辨识度相对M-b较差。进一步使用LT-A与WT的DNA样品进行LAMP特异性检验，结果显示，L-A反应呈橘红色，WT反应呈橘黄色。引物特异，检测结果辨识度高，检测结果稳定（图3）。

图3 LAMP反应的可视化验证

3.结论

LAMP反应可以高效的鉴别纯合的基因编辑材料。由

于LAMP扩增灵敏度高，通常产生假阳性结果，因此筛选出一套扩增效率高的LAMP引物是实验成功的关键，借助高效率的LAMP引物在相对较短的时间完成正确的扩增反应，并及时记录检测结果可以降低假阳性检出率。该方法能够高效的鉴别经基因编辑后产生的纯合突变材料。预先将反应体系冻干至384孔板，检测时仅需加入稀释后的样·96·

实验研究

品DNA，便能够高通量的对基因编辑后代材料进行鉴，从中筛选出纯合编辑材料。参考文献：

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基金项目：本项目由吉林省农业创新工程项目（CXGC-2017TD004和C92070502）资助通讯作者：魏健