复方中药对免疫抑制小鼠免疫促进作用的研究

论　著・　中国医药导报２０１４年２月第１１卷第４期　复方中药对免疫抑制小鼠免疫促进作用的研究　屈新辉　刘春发　胡建新　何　丹　项正兵１，２　吴晓牧１，２　１．江西省人民医院神经内科，江西南昌３３０００６；２．江西省神经病学研究所，江西南昌３３０００６；　３．南昌大学医学院，江西南昌３３０００６；４．江西省人民医院药剂科，江西南昌　３３０００６　［摘要】目的从细胞及分子水平，探求中药复方对免疫功能增强的作用及效能，在扶正固本、活血益气的中药中遴　选出有广阔应用前景的促进免疫的中药复方。方法５０只昆明小鼠随机分成正常对照组、模型对照组与高剂量　中药组、中剂量中药组、低剂量中药组。用环磷酰胺抑制小鼠免疫功能制作免疫抑制模型，观察用药后正常对照　组、模型对照组与高剂量中药组、中剂量中药组、低剂量中药组血清ＩｇＧ、补体Ｃ３，脾淋巴细胞表面抗原标志物　ＣＤ３　、ＣＤ４　、ＣＤ８　、ＣＤ４＋／ＣＤ８　、ＣＤ１９　、ＣＤ４９ｂ　，脾淋巴细胞细胞因子ＩＬ一２和ＩＦＮ一　及体重和脾指数。结果与模　型对照组相比，高剂量中药组、中剂量中药组、低剂量中药组体重和脾指数、ＣＤ３　、ＣＤ４　、ＣＤ８　、ＣＤ４＋／ＣＤ８　、ＣＤ１９　差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），低剂量中药组血清ＩｇＧ降低『（１７７．１９￣４５．６６）ｇ／Ｌ］，ＣＤ４９ｂ　、补体Ｃ３及脾淋巴细胞细　胞因子ＩＬ一２和ＩＦＮ一　升高［（３２．４３￣６．３１）％、（２９４．０￣６１．２）ｇ／Ｌ、（３８．４４￣７．８２）％、（２２．１１￣６．２９）％］，差异均有统计学意　义（均Ｐ＜０．０５），中剂量中药组脾淋巴细胞细胞因子ＩＬ一２和ＩＦＮ一＾ｙ升高［（３５．４０￣４．５９）％、（２２．２６￣８．８４）％］，差异均　有统计学意义（均Ｐ＜０．０５）。正常对照组与模型对照组比较，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论尽管还未能证　实复方中药对特异性细胞免疫和体液免疫有促进作用，但在一定剂量范围内对非特异性细胞免疫和体液免疫有　显著促进作用。　．　【关键词１免疫促进；复方中药；小鼠　［中图分类号】Ｒ２８５．５　［文献标识码】Ａ　［文章编号］１６７３—７２１０（２０１４）０２（ａ）一０００４—０５　Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｏｎ　ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｉｃｅ　ｐｒｏ－　ｍｏｔｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ＱＵ　Ｘｉｎｈｕｉ　・。ＬＩＵ　Ｃｈｕｎｆ￣ＨＵ　Ｊｉａｎｘｉｎ４　ＨＥ　Ｄａｎｚ　ＸＩＡＮＧ　Ｚｈｅｎｇｂｉｎｄ’。ＷＵ　Ｘｉａｏｍｕ　。　１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ　Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｐｅｏｐｌｅ　ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｎａｎｃｈａｎｇ　３３０００６，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｎａｎｃｈａｎｇ　３３０００６，Ｃｈｉｎａ；３．Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｎａｎ—　ｃｈａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｎａｎｃｈａｎｇ　３３０００６，Ｃｈｉｎａ；４．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｔｈｅ　Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｐｅｏ－　ｐｉｅ＇ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｎａｎｃｈａｎｇ　３３０００６，Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｅｌｅｃｔ　ｔｈｅ　ｎｅｗ　ｂｒｏａｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｓｐｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｆｏｒ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｂｙ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｆｒｏｍ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　Ｆｕｚｈｅｎｇ　Ｇｕｂｅｎ　ａｎｄ　Ｈｕｏｘｕｅ　Ｙｉｑｉ　ｏｆ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｆｉｔｆｙ　Ｋｕｎｍｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｆｉｖｅ　ｇｒｏｕｐｓ：ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｄｏｓｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｍｉｄｄｌｅ　ｄｏｓｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｏｗ　ｄｏｓｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｙｃｌ０ｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｉｃｅ．Ｓｅｒｕｍ　ＩｇＧ，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３，ｓｐｌｅｎｉｃ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　ＣＤ３　，ＣＤ４　，ＣＤ８＋，ＣＤ４ｑＣＤ８　，ＣＤ１９　，ＣＤ４９ｂ　，ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＬ一２　ａｎｄ　ＩＦＮ一　，　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｂｏｄｙ　ａｎｄ　ｓｐｌｅｅｎ　ｉｎｄｅｘ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．，ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｄｏｓｅ　Ｃｈｉ—　ｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｍｉｄｄｌｅ　ｄｏｓｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｏｗ　ｄｏｓｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｏｂ—　ｓｅｒｖｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｗｅｉｇｈｔ　ａｎｄ　ｓｐｌｅｅｎ　ｉｎｄｅｘ，ＣＤ３　，ＣＤ４　，ＣＤ８　，ＣＤ４＋／ＣＤ８　，　ＣＤ１９　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｄｏｓｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｍｉｄｄｌｅ　ｄｏｓｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｌｏｗ　ｄｏｓｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｇｒｏｕｐ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ，ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ　ｓｅｒｕｍ　ＩｇＧ　ｏｆ（１７７．１９￣４５．６６）ｇ／Ｌ　ａｎｄ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ＣＤ４９ｂ　ｏｆ（３２．４３￣６＿３１）％，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３　ｏｆ（２９４．０￣６１．２）ｇ／Ｌ，ｓｐｌｅｎｉｃ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ＩＬ一２　ｏｆ（３８．４４￣７．８２）％　【基金项目】江西省卫生厅中医药科研基金课题（编号　ａｎｄ　ｓｐｌｅｎｉｃ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ＩＦＮ－　ｏｆ（２２．１　１＋－６－２９）％　２００５Ａ６５）。　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｏｗ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｇｒｏｕｐ　［作者简介】屈新辉（１９７０一），男，主任医师，硕士生导师，主　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ａｌｌ　Ｐ＜０．０５），ｏｆ　ｓｐｌｅｅｎ　ｌｙｍ—　要从事神经免疫、运动障碍疾病及干细胞治疗。　ｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ＩＬ－２　ｏｆ（３５．４０￣４．５９）％ａｎｄ　ＩＦＮ－＾ｙ　ｏｆ　通讯作者　ｆ２２．２６￣８．８４）％ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｉｄｄｌｅ　ｄｏｓｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ＣＨＩＮＡ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＨＥＲＡＬＤ　Ｖｏ１．１　１　Ｎｏ．４　Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２０１４　中国医药导报２０１４年２月第１１卷第４期　・论　著・　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｇｒｏｕｐ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｉｔ　ｉｓ　ｓｔｉｌｌ　ｎｏｔ　ｃｏｎｆｉｍｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｈａｓ　ａ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ａｎｄ　ｈｕｍｏｒａｌ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｔｈｅ　ｎｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｈｕｍｏｒａｌ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　ａ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｄｏｓｅ　ｒａｎｇｅ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ；Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｍｉｃｅ　免疫学是现代医学发展极为迅速的学科之一．疾　１６３１）：ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ流式细胞仪；酶标仪　（５５０型）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；光学显微镜（ＯＬＹＭ—　病发生发展很多都与免疫功能有关，某些肿瘤患者在　放疗、化疗后或一些病毒感染后致免疫性力低下，但　ＰＵＳ）；红细胞裂解液（实验室制自备）；ＰＢＳ缓冲液（实　临床增强免疫力有明显临床疗效的药物却不多见。祖　验室制自备）；１６号小鼠灌胃针；Ａｌｌｅｇｒａ　６４Ｒ低速冷　国医学认为“正虚邪扰”，疾病与人体的抵抗力密切相　冻离心机（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ，ｒｎ￣ｘ＝２０４　ｍｍ）；ＨＣ　关，并且临床处方运用扶正祛邪的法则治疗疾病，临　床观察亦有疗效，许多学者研究了多种单味药对免疫　功能的调节作用，尝试发现、提取、合成能调节免疫的　化合物，本实验旨在从细胞及分子水平出发，探求中　药复方对免疫功能增强的作用及效能，在扶正固本、　活血益气的中药中遴选出有广阔应用前景的促进免　疫的中药复方。　１材料与方法　１．１材料　电子天平（０．１　ｇ）、ｓａｒｒｏｒｉｏｕｓ电子天平（０．００１　ｇ），３００　目金属筛网。　１．２方法　１．２．１药物急性毒理试验　该复方中药各组份临床应用广泛，未见明显毒副　作用，因此用小鼠灌胃最大容量０．４　ｍＵｌＯ　ｇ回来检查　药物的ＬＤ如，取２０只小鼠，每次灌胃复方中药０．８　ｍＬ，　２次／ｄ，观察１５　ｄ，无一死亡，可见ＬＤ５０＞０．４　ｍＬ／ｌＯ　ｇ。　１．２．２实验分组　１．１．１中药的制备　应用随机数字表法进行随机将动物分为５组：正　常对照组、模型对照组、低剂量中药组、中剂量中药　组的雌雄性小鼠分别称重，按序编号记录体重结果，　给每只小鼠鼠分配一个随机数，按随机数字大小升序　复方中药（由西洋参、黄芪、枸杞、当归等多味药）　当归８０　ｇ）称取处方各药（由江西省人民医院药剂科　供应），加蒸馏水４００　ｍＬ，浸泡２４　ｈ，隔水煮１　ｈ，滤过　药液，药渣再加蒸馏水适量，煮１　ｈ，滤出药液，合并两　组成，按总量４００　ｇ（西洋参９６　ｇ、黄芪９６　ｇ、枸杞１２８　ｇ、　组、高剂量中药组。每组１０只，雌雄各半。将需随机分　排序，按排序后的顺序依次将小鼠分入各个剂量组。　Ｐ＞０．０５．如果条件不能满足，则重复以上过程，直到　次药液，隔水浓缩至４００　ｍＬ，即每１　ｍＬ相当于１　ｇ　各组体重均值再做Ｆ检验（单因素方差分析），需满足　生药的原液，灭菌封存备用。　１．１．２实验动物　满足为止。随机分组结束后，分别按各组的原始编号　编上实验编号。　１．２．３小鼠免疫抑制模型　６周龄昆明小鼠５０只，体重（２０＿＋２）ｇ，雌雄各半，　均购自江西中医学院。动物自由饮食、饮水，动物质量　合格证号：ＪＩＤＷ　ＮＯ．２０１２—００４１。试验过程中对动物　建立小鼠免疫抑制模型一次性腹腔注射环磷酰　溶剂生理盐水４　ｍｌｄｋｇ。　１．２．４给药方法　ｋｇ，造模完成Ｉ３＿。正常对照组注射环磷酰胺　的处置符合２００６年科技部关于对试验动物的有关规　胺２００　ｍｇ／定［１ｌ。　１．１．３试剂与仪器　免疫抑制剂环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公　和补体Ｃ３的ＥＬＩＳＡ检测试剂盒为西唐生物公司进　中药治疗组于环磷酰胺造模后第２天开始用中　中剂量中药组灌中药０．０２　ｍｕｇ＋蒸馏水０．０２　ｍｕｇ，　司，批号：１２０３０６２５），为２００　ｍｇ／支的粉针剂；小鼠ＩｇＧ　药按小鼠体重灌胃，高剂量中药组灌中药０．０４　ｍｕｇ，　口分装产品（批号分别为：１２０８０６１、１２０８２０１）；Ａｎｔｉ—　低剂量中药组灌中药０．Ｏ１　ｍｕｇ＋蒸馏水０．０３　ｍｕｇ，　０４　ｍｕｇ，喂服　ＭｏｕｓｅＣＤ３（ＰＥ－４２ｙ５）、Ａｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＣＤ４（ＦＩＴＣ）、Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　正常对照组、模型对照组均灌蒸馏水０．ＣＤ８（ＰＥ）、Ａｎｔｉ—Ｍｏｕｓｅ　ＣＤ１９（ＰＥ）、Ａｎｔｉ—ＭｏｕｓｅＣＤ４９　（ＦＩＴＣ）、Ａｎｔｉ—ＭｏｕｓｅＩＬ－２（ＰＥ）、Ａｎｔｉ—ＭｏｕｓｅｌＦＮ－＇，／（ＦＩＴＣ）　１４　ｄ。　１．２．５实验指标的检测　荧光抗体（购于ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ公司，　批号分别为Ｅ０６０６５—１６３０、Ｅ０００７７—１６３０、Ｅ０１０３６—　１６３３￣０１０４７－１６３０、Ｅ００７５２－１６３０Ｚ０２０６０＿１６３０￣００８６２—　１．２．５．１体重和脾脏指数各组小鼠称量体重，于试验　结束后断颈处死，取脾脏，用电子天平称湿重，计算脾　指数．脾脏指数＝１００％脾脏质量／体质量（ｇ／ｇ）　ＣＨＩＮＡ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＨＥＲＡＬＤ　Ｖｏ１．１　１　Ｎｏ．４　Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２０１　４　・论　著・　中国医药导报２０１４年２月第１１卷第４期　１．２．５．２　ＩｇＧ和补体Ｃ３的检测于试验第１４天摘取眼　球取血，室温放置２　ｈ后３０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ将血　清和红细胞迅速小心地分离，离　ｔ２，得血清后严格按照　ＥＬＩＳＡ试剂盒说明书方法检测小鼠血清ＩｇＧ和补体　Ｃ３水平。　２．２各组抗体ＩｇＧ、补体及ＣＤ１９结果比较　模型对照组比正常对照组ＩｇＧ显著增高（Ｐ＝０．００２　＜０．０１）．Ｃ３显著降低（正态分布方差不齐ｔ检验，Ｐ＝０．叭１　＜０．０５），而低剂量中药组与模型对照组比较，差异有　高度统计学意义（Ｐ＝０．００１＜０．０１），表明低剂量中药　１．２．５．３脾淋巴细胞ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ４９ｂ　ＮＫ　细胞、细胞因子ＩＬ一２、ＩＦＮ一　检测第１４天取小鼠脾　脏研磨成单细胞悬液经筛网过滤于离心管中离一ｔ２，，弃　组能显著降低免疫抑制小鼠抗体ＩｇＧ的浓度，升高免　疫抑制小鼠补体Ｃ３浓度。见表２。　表２抗体、补体及Ｂ淋巴细胞表面抗原ＣＤ１９结果比较（ｉ±５）　上清再加入红细胞裂解液离心．弃上清后加入ＰＢＳ　定容至１　ｍＬ，用倒置相差显微镜进行细胞计数，调节　细胞数为１×１０　～１０ｘｌ０　个，加入标记抗小鼠ＣＤ３、　ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ４９ｂ　ＮＫ细胞、细胞因子ＩＬ一２、　ＩＦＮ一＾ｙ荧光抗体抗体，４　避光孵育３０　ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤　２次，流式细胞仪检测淋巴细胞和细胞因子指标的　变化。　１．３统计学方法　注：与模型对照组比较，　＜Ｏ．０５，　＜Ｏ．０Ｉ　２．３各组脾淋巴细胞ＣＤ３　、ＣＤ４　、ＣＤ８　、ＣＤ４　／ＣＤ８　结果比较　采用ＳＰＳＳ　１９．０统计分析软件分析，所有计量资　料数据以均数±标准差（元　）表示，采用ｔ检验。将资　料进行正态性分析和Ｌｅｖｅｎｅ法方差齐性检验．行两　ＣＤ３　、ＣＤ４　、ＣＤ　模型对照组均值均低于正常对　照组（Ｐ＜０．０５），ＣＤ３　、ＣＤ４　、ＣＤ８　、ＣＤ４＋／ＣＤ８　模型对　独立样本ｔ检验，多组间比较采用单因素方差分析，　方差齐性采用ＬＳＤ—ｔ检验，方差不齐采用Ｔａｍｈａｎｅ法　检验。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　２结果　照组水平与低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中　药组水平比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），显示复　方中药对特异性Ｔ淋巴细胞和Ｂ淋巴细胞免疫无促　进作用。见表３。　表３　Ｔ淋巴细胞表面抗原结果比较（ｉ±　）　２．１体重和脾指数结果比较　正常对照组和模型对照组与各治疗组第ｌ天的　体重均值比较，差异无统计学意义（Ｐ＝０．２１６＞０．０５），　表明随机分组成功。第ｌ４天的体重模型对照组比正　常对照组减轻，差异有统计学意义（Ｐ＝０．０２０＜０．０５）。　组别　只数ＣＤ３　（％）　ＣＤ４　（％）　ＣＤ８　（％）　ＣＤ４＋／ＣＤ８　而模型对照组与各治疗组体重比较。差异无统计学意　义（Ｐ＝０．１２６、０．９０４、０．７９６，均Ｐ＞０．０５），表明小鼠免疫　抑制后引起体重减轻．而各复方中药治疗组对免疫抑　制小鼠体重无影响。脾指数模型对照组比正常对照组　降低（Ｐ＝Ｏ．０００１＜０．０５），而模型对照组与各治疗组比较，　差异无统计学意义（Ｐ＝Ｏ．９６７、０．２５５、０．９４１＞０．０５），表明　注：与模型对照组比较，　＜０．０５　２．４各组脾淋巴细胞ＣＤ４９ｂ　结果比较　ＣＤ４９ｂ　、ＩＬ一２、ＩＦＮ一　模型对照组水平均低于正　常对照组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），　小鼠免疫抑制后引起脾指数降低，而各复方中药治疗　组对免疫抑制小鼠脾指数无影响。见表１。　表１　各组体重和脾指数比较（　低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组均值均　增高。但仅低剂量中药组ＣＤ４９ｂ　与模型对照组比较，　差异有高度统计学意义（Ｐ＝０．００８＜０．０１），表明小剂　量复方中药对免疫抑制小鼠非特异性免疫ＮＫ细胞　有免疫促进作用。ＩＬ一２、ＩＦＮ一　低剂量中药组、中剂量　中药组与模型对照组比较，差异有统计学意义（ＩＬ一２：　Ｐ＝０．００４、Ｐ＝０．０３９；ＩＦＮ一　：Ｐ＝０．０２６、Ｐ＝Ｏ．０２４，Ｐ＜０．０５　或Ｐ＜０．０１），表明小剂量、中剂量复方中药对免疫抑　制小鼠非特异性免疫细胞因子ＩＬ一２及ＩＦＮ一　有免疫　注：与模型对照组比较．　＜０．０５　促进作用。见表４。　谶ＣＨＩＮＡ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＨＥＲＡＬＤ　Ｖｏ１．１　１　Ｎｏ．４　Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２０１４　中国医药导报２０１４年２月第１１卷第４期　・论　著・　表４各组ＮＫ细胞及细胞因子比较（％，ｉ　）　本实验观察复方中药各剂量组与模型组比较对　ＣＤ３　、ＣＤ４￣，ＣＤ８＋，ＣＤ４７ＣＤ８＋，ＣＤ１９　均无差异，因此未　能证实其对特异性细胞免疫及体液免疫有促进作用。　以往有报道西洋参多糖对６０℃射线照射致免疫抑制　模型小鼠可增强Ｃｏｎ　Ａ诱导的小鼠脾Ｔ淋巴细胞转　注：与模型对照组比较，　＜Ｏ．０５，　＜０．０１　化能力，增强小鼠迟发型变态反应能力［刀：黄芪多糖对　正常小鼠可增强Ｃｏｎ　Ａ诱导的小鼠脾Ｔ淋巴细胞转　３讨论　化能力嘲；当归多糖明显促进健康人外周血Ｔ淋巴细　胞增殖　：枸杞多糖明显增强植物凝集素ＰＨＡ活化的　人外周血淋淋巴细胞的增殖㈣。复方中药中四种单味　机体的免疫功能主要与Ｔ淋巴细胞和Ｂ淋巴细　胞、单核巨噬细胞、ＮＫ自然杀伤细胞等免疫细胞及抗　体、补体、免疫细胞产生的细胞因子有关。特异性免疫　药均可促进Ｔ淋巴细胞免疫力，而组成的复方反而未　与Ｔ淋巴细胞、Ｂ淋巴细胞及Ｂ淋巴细胞活化产生的　得出促进Ｔ淋巴细胞免疫的结论．这可能与免疫模型　抗体有关，非特异性免疫与单核巨噬细胞、ＮＫ自然杀　不同引起药物对机体敏感性不同有关．还与观察Ｔ淋　伤有关，而补体及细胞因子广泛参与特异性免疫与非　巴细胞指标不同及检测方法不同有关。　特异性免疫。根据中医药理论和现代药理研究表明：　补体是存在于血清和组织液中经活化后具有酶　西洋参补气养阴，清热生津，主要活性成分为皂苷类、　活性的蛋白质，补体成分可与多种免疫细胞相互作　多糖类和氨基酸类等，其中的活性多糖可以通过激活　用，调节细胞增殖、分化，补体Ｃ３等可参与固定抗原，　网状内皮系统、补体、激活巨噬细胞和Ｔ、Ｂ淋巴细胞，　使抗原易被ＡＰＣ处理与递呈，参与免疫应答的诱导，　诱生多种免疫因子等途径对机体免疫产生广泛的影　并参与清除免疫复合物及免疫记忆。补体系统是具有　响，从而提高机体免疫力　；黄芪益气固表，能调节免　重要生物学作用的效应级联放大系统。补体途径分为　疫功能，可治疗气虚感冒；枸杞滋补肝肾，能提高机体　经典、替代和外源凝集素途径［１１］，补体Ｃ３是补体激活　免疫功能，延缓抗衰老，长期服用可增强免疫功能；当　的三个级联的一个关键组成部分［１２］．因此本实验选择　补体Ｃ３指标作为观察补体系统功能。低剂量中药组　归补血活血．具有抗炎和改善血管功能的作用［５］。本文　与模型对照组比较补体Ｃ３显著升高（Ｐ＝０．０００１＜０．０１），　以常用补益剂西洋参、黄芪、当归、枸杞组成的复方中　表明低剂量中药组能显著升高免疫抑制小鼠补体Ｃ３　药汤剂为研究对象，全方具有补气活血、滋补肝肾，滋　浓度，显著促进免疫抑制小鼠补体系统的功能。　阴益阳作用。观察其对免疫器官、免疫细胞、抗体、补　本实验免疫抑制模型对照组与正常对照组比较　体、细胞因子等不同层面免疫功能的影响，探求其增　抗体ＩｇＧ是升高的，差异有高度统计意义（Ｐ＝０．００２），　强免疫的机制。　而高剂量中药组、中剂量中药组、低剂量中药组ＩｇＧ　正常对照组和模型对照组与各治疗组第１天的　均值依次降低，且低剂量中药组与模型对照组比较。　体重均值比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），表明随　差异显著（Ｐ值＝Ｏ．００１），表明低剂量中药组能显著降　机分组成功。环磷酰胺为常有免疫抑制剂，为细胞周　低免疫抑制小鼠抗体ＩｇＧ的浓度。机体抗原免疫后血　期非特异性细胞毒药物，其免疫抑制机制为对骨髓强　清中的抗体其中ＩｇＭ检出时间最早，ＩｇＧ检出时间较　大抑制作用，致Ｔ、Ｂ淋巴细胞绝对数量减少，并抑制　晚但存留时间最长，ＩｇＡ检出时间最晚【　。本实验Ｂ淋　淋巴细胞受特异性抗原刺激后母细胞的转化同。本实　巴细胞抗原ＣＤＩ９　在免疫抑制后下降，因ＩｇＧ产生时　验采用其制作免疫抑制动物模型。实验结束后观察到　间较晚但存留时间最长。在实验１４　ｄ的时间节点上．　体重、脾指数、ＣＤ３￣，ＣＤ４＋，ＣＤ８￣，ＣＤ１９＋，ＮＫ细胞、补体　ＩｇＧ主要是造模前存留的，因此理论上模型组与正常　Ｃ３、细胞因子ＩＬ一２、ＩＦＮ一　均降低，且差异有统计学　对照组应无统计学差异。通常抗原与抗体结合．在补　意义（Ｐ＜０．０５），表明建立免疫抑制动物模型成功。模　体的参与下，抗原与抗体结合产生几何级联放大效　型对照组与各治疗组体重和脾指数无差异（Ｐ＞０．０５），　应，清除抗原的同时消耗了抗体，补体升高会导致抗　各复方中药治疗组对免疫抑制小鼠体重和脾指数无　体降低，补体降低也会导致抗体升高。本实验免疫抑　影响，表明其在免疫器官层面无显著性作用。脾指数　制后对补体也造成了强大的抑制，因而出现正常对照　模型对照组比正常对照组降低（Ｐ＝Ｏ．０００１），可能与促　组ＩｇＧ抗体低，模型组ＩｇＧ抗体升高。本实验Ｂ淋巴　进免疫器官的生长作用因环磷酰胺对机体抑制作用　细胞抗原ＣＤ１９　各中药治疗组与模型组无差异，其一　过强而显现不出来有关。　定程度上反映了机体体液免疫功能，体液免疫产生的　ＣＨＩＮＡ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＨＥＲＡＬＤ　Ｖｏ１．１　１　Ｎｏ．４　Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２０１４　・论　著・　中国医药导报２０１４年２月第１１卷第４期　２】赵钧铭，应红光，李长虹，等．振明正生对人肿瘤细胞裸　抗体理论上亦无差异．因此认为低剂量中药组ＩｇＧ降　［低是因为低剂量复方中药可显著升高补体所引起的。　鼠移植瘤的抑制作用及其急性毒性试验［Ｊ】．现代肿瘤医　学，２００９，１７（４）：６３１－６３３．　ＮＫ自然杀伤细胞对病原体无严格选择性，能识　别多种病原体的共有成分，对多种病原体均有吞噬、　［３】高璨春，张金超，陈瑶，等．补中益气汤的ＬＣ—ＭＳ分析及　其对免疫抑制小鼠的调节作用［Ｊ］．中草药，２００６，３７（８）：　ｌ１３４—１　１３７．　杀伤作用。ＮＫ细胞是产生细胞因子ＩＦＮ一　主要的先　天免疫细胞，ＮＫ细胞不需要事先暴露于抗原发挥其　功能．通过自然的细胞毒性和的分泌细胞因子发挥　【４］王阶，林洪生，李勇，等．免疫２号方对艾滋病免疫重建　不全患者临床症状、体征的影ＭＪ［Ｊ］．中医杂志，２０１２，５３　（１１）：９２３—９２６．　防止微生物的侵袭和传播的重要的免疫效应，ＮＫ细　胞是天然免疫和获得性免疫功能之间的桥梁，先天　第一线防御癌症和病原体的入侵的关键【ｌ４］。ＣＤ４９是　小鼠ＮＫ细胞主要标志物，本实验选用其作为观察　ＮＫ细胞的功能指标。复方中药低剂量组与模型组比　较可显著升高ＣＤ４９（Ｐ＝０．００８＜０．０１），显示低剂量复　方中药能有效促进ＮＫ自然杀伤细胞数量。在此需要　说明的是复方中药表现出的对机体免疫促进作用并　不是由于中和环磷酰胺的药效而引起的．因为环磷　［５】韩洁，岳文鹏，何光志，等．八种中药多糖对小鼠巨噬细　胞释放细胞因子的影响［Ｊ］．现代免疫学，２０１１，３１（６）：４９５—　４９８．　［６】包晶晶，林海霞，马磉．ＣＦＳＥ示踪与流式细胞仪检测法　研究环磷酰胺对Ｔ淋巴细胞增殖的影响【Ｊ］．中国药理学　通报，２０１０，２６（６）：８２８—８３１．　［７］于永超，张佳丽，林兵，等．西洋参多糖对钴一６０辐照小鼠　的免疫调节作用［Ｊ］．现代预防医学，２０１２，３９（１１）：２６８５—　２６８７．　酰胺的半衰期为４　ｈ，２４　ｈ后已经过了６个半衰期。　机体环磷酰胺的血药浓度仅有１／６４．因此２４　ｈ后喂　【８】郭曦，王继宏，肖雪珍，等．４种中药多糖对小鼠脾淋巴　服中药不存在中和环磷酰胺的药效，表明小剂量复　细胞增殖的影响ｆＪ１．中国兽医杂志，２０１１，４７（８）：５６—５９．　方中药对免疫抑制小鼠非特异性免疫ＮＫ细胞有免　疫促进作用。　辅助性Ｔｈｌ细胞受抗原刺激分泌细胞因子ＩＬ一２　和ＩＦＮ一　，ＩＬ一２刺激ＣＴＬ细胞增殖与分化，ＩＦＮ一　可　［９９］耿卫朴，徐曼，罗袢，等．灵芝多糖和当归多糖促进人外　周血Ｔ淋巴细胞增殖和分泌ＩＦＮ一－ｙ［Ｊ１．中国药理学通报，　２０１２，２８（５）：６５５—６５８．　［１０］董永杰，单铁英，岳峰，等．枸杞多糖对淋巴细胞功能的　影响【Ｊ］．现代中西医结合杂志，２０１０，１９（１９）：２３６２－２３６３．　［１　１】Ｓｃｈｗａｂ　Ｊ，Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ　Ｃ，Ｒｉｃｈｔｅｒ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｖａｌａｉｓｉａｎａ　Ｒｅｓｉｓｔ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ——Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｋｉｌｌｉｎｇ　Ｉｎｄｅ・－　诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、皮肤成纤维细　胞、血管内皮细胞、星状细胞等ＭＨＣ　ＩＩ类抗原的表　达，使其参与抗原提呈和特异性免疫的识别过程：　ＩＦＮ一－，／还能增强巨噬细胞表面受体Ｆｃ的表达．促进　ｐｅｎｄｅｎｔｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ　ａｎｄ　巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤　细胞［　５１；ＩＬ一２和ＩＦＮ一　都可以增强ＮＫ细胞细胞毒活　性。因此ＩＬ一２和ＩＦＮ一＾，是反映机体免疫功能的重要　指标。本实验中剂量中药组及低剂量中药组与模型组　比较均能升高ＩＬ一２和ＩＦＮ一　（Ｐ＜０．０５），表明一定剂　量范围的复方中药对免疫细胞因子有促进作用。　本实验复方中药药理毒理试验未发现明显毒副　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，　２０１３，８（１）：ｅ５３６５９．　【１２】Ｍｏｇｉｌｅｎｋｏ　ＤＡ，Ｋｕｄｒｉａｖｔｓｅｖ　ＩＶ，Ｓｈａｖｖａ　ＶＳ，ｅｔ　ａ１．Ｐｅｒｏｘｉ—　ｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｕｔ　Ｉｎｈｉｂｉｔｓ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　—ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ３　Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｈｅｐａｔｉｃ－ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｃｅｌｌｓ『Ｊ１．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２０１３，２８８（３）：　１７２６－１７３８．　作用，但高剂量中药组对所有免疫指标均无促进作　用，说明药物剂量过大对机体还是有一定的不利影　【１３】齐雪峰，程安春，汪铭书，等．鸭瘟弱毒疫苗诱导ＩｇＡ、　ＩｇＭ和ＩｇＧ产生规律的研究［Ｊ］．中国农业科学，２００８，４１　（１０）：３３０５－３３１０．　响，中药中既使补益药，也有一定的副作用。虽然都是　补气养阴活血的补益药，正应了中医理论有“气有余　便是火”，补气有余易产生火邪。　因此，复方中药（由西洋参、黄芪、枸杞、当归等多　味药组成）在一定剂量范围内，虽然还未能证实对机　异性细胞免疫及体液免疫有显著促进作用。　［参考文献］　【１】科技部．关于善待实验动物的指导性意见『Ｓ１．２００６—９—１３．　ＣＨＩＮＡ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＨＥＲＡＬＤ　Ｖｏ１．１　１　Ｎｏ．４　Ｆｅｂｒｕａ￣２０１　４　［１４］Ｋｌｅｚｏｖｉｃｈ　ＢＭ，Ｃｏｒｒｅ　ＪＰ，Ｊｕｓｆｏｒｇｕｅｓ　ＳＨ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ＮＫ　ｃｅｌｌ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ　ｃｒｏｓｓｔａｌｋ：ａ　ｂａｌ—　ａｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｓｐｏｒｅｓ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｄｉｓｒｕｐ—　ｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｏｘｉｎｓ［Ｊ１．ＰＬｏＳ　Ｐａｔｈｏｇ，２０１２，８（１）：ｅ１００２４８１．　体特异性细胞免疫和体液免疫有促进作用，但对非特　【１５］刘英姿，罗有梁，周铁忠．原花青素Ａ一１调节ＣｏｎＡ刺　激小鼠脾细胞分泌Ｔｈｌ／Ｔｈ２细胞因子的影响『Ｊ］．免疫　学杂志，２０１２，２８（１１）：９４２—９４５．　（收稿日期：２０１３—１１－０５本文编辑：卫轲）