秀丽隐杆线虫-产碳青霉烯酶阴沟肠杆菌感染模型的建立及应用

中国抗生素杂志２０１　８年４月第４３卷第４期　文章编号：ｌＯ０１．８６８９（２０１８）０４一Ｏ４４４一Ｏ６　秀丽隐杆线虫．产碳青霉烯酶阴沟肠杆菌感染模型的建立及应用　曹玲１，２陈丽丹　肖斌　王丽志　黄晓燕　李林海１，’　（１广州军区广州总医院，广州５１００１０；２广州中医药大学，广州５１０４０５）　摘要：目的　建立秀丽隐杆线虫．产碳青霉烯酶阴沟肠杆菌感染模型，并利用该模型筛选体内有效治疗阴沟肠杆菌感染的　药物。方法　将产碳青霉烯酶的阴沟肠杆菌与线虫共培养，建立线虫．产碳青霉烯酶阴沟肠杆菌感染模型，选用７种临床常见的　抗菌药物（米诺环素、多西环素、庆大霉素、氨曲南、亚胺培南、替加环素和多黏菌素Ｂ）对感染后的线虫进行治疗，观察并记录　线虫的生存状态，根据线虫的存活率评价不同药物的疗效。结果　产碳青霉烯酶的阴沟肠杆菌能够感染线虫并致其死亡，通过　荧光探针标记可见细菌在线虫肠道内定植生长。使用多黏菌素Ｂ、替加环素、米诺环素、多西环素治疗后，线虫的生存率与对　照组相比显著提高。结论筛选。　成功建立了秀丽隐杆线虫一产碳青霉烯酶阴沟肠杆菌感染模型，并将该模型用于体内抗菌药物活性的　关键词：碳青霉烯酶；阴沟肠杆菌；秀丽隐杆线虫；抗菌药物　中图分类号：Ｒ９６５．１　文献标志码：Ａ　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ　Ｃａｏ　Ｌｉｎｇ　，。，Ｃｈｅｎ　Ｌｉ—ｄａｎ。，Ｘｉａｏ　Ｂｉｎ　，Ｗａｎｇ　Ｌｉ—ｚｈｉ　，Ｈｕａｎｇ　Ｘｉａｏ—ｙａｎ　ａｎｄ　Ｌｉ　ｌｉｎ—ｈａｉ　（１　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＧｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｃｏｍｍａｎｄ　ｏｆＰＬＡ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１００１０；　２　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５　１０４０５）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　Ｅ　ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ａｎｄ　ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｏ　ｕｓｅ　ｔｈｉｓ　ｍｏｄｅｌ　ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｄｒｕｇｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｏｆ　ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ．．ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ＣＯ．．ｃｕｌｔｕｒｅ　ｗｉｔｈ　ｎｅｍａｔｏｄｅ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａｎ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　Ｃａｅｎｏｒｈａｂ　ｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ—ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ．ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ．Ｓｅｖｅｎ　ｃｏｍｍｏｎ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｄｒｕｇｓ（ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ，ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，ａｚｔｒｅｏｎａｍ，ｉｍｉｐｅｎｅｍ，ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ，ａｎｄ　ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ　Ｂ）ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｔｒｅａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｎｅｍａｔｏｄｅｓ．Ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｓｔａｔｕｓ　ｏｆ　ｎｅｍａｔｏｄｅｓ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｒｄｅｄ．Ｔｈｅ　ｅｍｃａｃｙ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｒｕｇｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｎｅｍａｔｏｄｅｓ　ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ．ＲｅｓｕＩｔｓ　Ｈｉｇｈ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ｃａｎ　ｉｎｆｅｃｔ　ｎｅｍａｔｏｄｅｓ　ａｎｄ　ｃａｕｓｅ　ｔｈｅｉｒ　ｄｅａｔｈ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｂｅｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｃｏｕｌｄ　ｇｒｏｗ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｕｔ．Ｔｈｅ　ｎｅｍａｔｏｄｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ　Ｂ，ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ，　ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ，ａｎｄ　ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｉｃａｎｔｌｆｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　Ｃａｅｎｏｒｈａｂ　ｆｉｓ　ｅｌｅｇａｎ—ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏｏｃａｅ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．ａｎｄ　ｃａｌｌ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｏｒ　ｆｉｎ　ｖｉｖｏ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ；Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔ　ｅｌｅｇａｎｓ；Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ　收稿日期：２０１７—０５—０９　作者简介：曹玲，女，生于１９９２年，在读硕士研究生，主要从事细菌耐药机制研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｍ１３７２４０８６５５７＠１６３．ｃｏｒｎ　’通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｍａｔｕｒｅ３０３＠１２６．ｔｏｍ　秀丽隐杆线虫．产碳青霉烯酶阴沟肠杆菌感染模型的建立及应用　曹玲等　４４５　阴沟肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）属于肠杆菌科　肠杆菌属，是一种机会致病菌，也是临床上常见的　感染性病原体【１］。阴沟肠杆菌可以通过人的皮肤伤口　基：３ｇ　ＫＨ２ＰＯ４，６ｇ　ＮａＨＰＯ４’１２Ｈ２Ｏ，５ｇ　ＮａＣｌ，０．２５ｇ　ＭｇＳＯ　，加入蒸馏水１Ｌ，高压灭菌后备用；Ｋ液：　３．１ｇ　ＮａＣ１，２．３９ｇ　ＫＣ１溶于ｌＬ蒸馏水高压备用；脑心　浸液（ｂｒａｉｎ　ｈｅａｒｔ　ｉｎｆｕｓｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ，ＢＨＩ）；线虫裂解液：　０．４ｇ　ＮａＯＨ，２ｍＬ　ＮａＣＩＯ，溶于４ｍＬ的蒸馏水中，现　配现用。　直接侵入并感染人体，或通过各种侵入性操作（如：　留置导尿管、静脉穿刺、机械通气等）所产生的通道　进入机体。此外，机体免疫力低下或长期使用抗生　素导致的肠道菌群失调也容易引发其感染。阴沟肠　１．１．４药物　杆菌感染能扩散到人体呼吸道、泌尿道、血液系统　等多个部位，若不及时治疗将扩散至全身【ｚ】。由于抗　亚胺培南购自大连美仑生物技术有限公司，替　加环素、氨曲南、庆大霉素、米诺环素、多西环素　生素的大量使用，临床上出现了越来越多广泛耐药　的阴沟肠杆菌。自２００３年报道的首例产ＶＩＭ一２（ｖｅｒｏｎａ　ｉｎｔｅｇｒｉｎｅｎｃｏｄｅｄｍｅｔｔａｌｌｏ．Ｄ．１ａｃｔａｍａｓｅ）型金属酶的阴沟　肠杆菌【，］，产碳青霉烯酶阴沟肠杆菌逐渐被人们认　识。产碳青霉烯酶阴沟肠杆菌的出现使临床治疗药　物的选择面临局限性，需要通过多种更加直接，简　单的方式筛选新的药物。　秀丽隐杆线虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）（以下简称　线虫）是筛选抗感染药物的经典模式生物，目前已利　用线虫建立感染模型的病原体有金黄色葡萄球菌、　粪肠球菌、李斯特菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆　菌和沙门菌等【引。线虫的虫体小、易保存、易饲养　及观察、生命周期短，且与人类基因组具有高度同　源性，这些优点使其成为抗感染药物筛选的经典模　型。本研究在此基础上建立秀丽隐杆线虫．产碳青霉　烯酶的阴沟肠杆菌感染模型，并进行初步的药物筛　选，为深入研究阴沟肠杆菌感染的作用机制及临床　用药奠定基础。　１材料和方法　１．１材料　１．１．１线虫和细菌　临床分离的阴沟肠杆菌由广州军区广州总医院　检验科临床微生物室提供，大肠埃希菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＯＰ５０、秀丽隐杆线虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ　ｇｌｐ一　４，ｓｅｋ一１）由广州军区广州总医院药剂科提供。　１．１．２仪器　ＶＩＴＥＫ．２型全自动细菌鉴定仪购自法国Ｍ６ｒｉｅｕｘ　公司，ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００购自美国ＡＢＩ公　司；ＤＹ－ＣＰ一３　１ＤＮ型电泳仪购自北京六一生物科技公　司，ＧＳＧ一２０００核酸／蛋白质凝胶成像系统购白珠海黑　马医学仪器有限公司。　１．１．３培养基　ＮＧＭ（Ｎｅｍａｔｏｄｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｍｅｄｉａ）培养基；Ｍ９培养　购白阿拉丁生物试剂公司。药物母液配制：亚胺培　南、替加环素、多黏菌素Ｂ、米诺环素、多西环素均　按美国临床和实验室标准协会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＬＳＩ）指导标准进行溶解，配制成　６４ｍｇ／ｍＬ储备液，分装后于一２０￣Ｃ贮存备用。　１．２方法　１．２．１　ＰＣＲ扩增碳青霉烯酶基因　采用热激法提取细菌ＤＮＡ，用ＶＩＭ、ＫＰＣ、　ＮＤＭ、ＩＰＭ、ＯＸＡ．４８酶基因特异性引物扩增耐碳青　霉烯类阴沟肠杆菌的耐药基因，引物序列由上海捷　瑞生物公司合成。　１．２．２体外药敏试验　采用微量肉汤稀释法测定相应药物对阴沟肠杆菌　的体外最低抑菌浓度（ｍｉｎｉｍａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，　ＭＩＣ）。判断标准参ＣＬＳＩＭ０７一Ａ　１　０版。　１．２．３线虫同步化实验　当ＮＧＭ板上线虫产卵较多时，进行线虫同步　化实验。用线虫裂解液将虫体裂解干净，仅留下虫　卵。将虫卵置于涂有ＯＰ５０的ＮＧＭ板上，在２５℃温箱　中培养３ｄ，得到同步化生长的线虫成虫。　１．２．４不同培养基对线虫致死时间的影响　将同步化的Ｌ４期线虫分别用Ｍ９、１０％ＢＨＩ．Ｍ９培　养基、２０％ＢＨＩ—Ｍ９培养基重悬，与阴沟肠杆菌共培　养，观察３种培养基对线虫致死时间的影响。　１．２．５　线虫．产碳青霉烯酶阴沟肠杆菌模型致死时间　的确定　用２０％ＢＨＩ—Ｍ９培养基从平板上洗下培养至成　虫Ｌ４期的线虫，离心洗涤线虫表面的大肠埃希菌　ＯＰ５０（５００ｒ／ｍｉｎ，ｌｍｉｎ）２～３次，重悬后取１００ｐＬ悬液在　显微镜下观察线虫数量，根据计数结果取１　５～２０条线　虫铺于９６孔板的各孔中。感染组各孔分别加入终浓　度为１０７、１０６、１０５５￣Ｄ１０４ＣＦＵ／ｍＬ的菌液ｌＯＯｐＬ，空白　对照组加入２０％ＢＨＩ．Ｍ９培养基。　４４６　１．２．６细菌感染线虫的示踪　将阴沟肠杆菌重悬于２ｍＬ的Ｍ９液，加入１　Ｄｉｌ　储备液（２ｍｇ细胞膜荧光探针Ｄｉｌ粉末溶于１ｍＬ　Ｎ，Ｎ一　二甲基甲酰胺１，２５℃避光孵育３ｈ。离心洗涤菌体至　少３次，调整菌浓度至１０　ＣＦＵ／ｍＬ后感染线虫。１２ｈ　后，用Ｍ９液洗涤线虫至上清液完全无色，用倒置荧　光显微镜观察虫体荧光。　１．２．７利用线虫一产碳青霉烯酶阴沟肠杆菌模型筛选　体内有效药物　用２０％ＢＨＩ—Ｍ９培养基洗涤Ｌ４期同步化的线虫　２～３次，加入终浓度为１０　ｃＦｕ／ｍＬ的菌液，共培养　１２ｈ，再用２０％ＢＨＩ—Ｍ９培养基洗涤３次，将线虫表面　的菌液洗下，在２０％ＢＨＩ—Ｍ９培养基中非共培养１２ｈ，　确保阴沟肠杆菌成功感染线虫且排除培养液中的菌　体对后续实验的影响。取１８０ｐＬ感染后的线虫分别　加入９６孔板的各孔中，治疗组另分别加入ｌ０×ＭＩＣ的　米诺环素、多西环素、亚胺培南，庆大霉素、氨曲　南、替加环素和多黏菌素Ｂ各２０ｐＬ，阴性对照孔加入　２０ｐＬ含２０％ＢＨＩ—Ｍ９培养基。根据治疗后线虫的活性　ｔ　∞　∞ｍ　７　恢复情况调整药物浓度，探索最优的抗菌药物治疗　浓度范围。　１．３统计学分析　采用Ｋａｐｌａｎ—Ｍｅｉｅｒ生存分析法对线虫生存时间进　行分析，ｌｏｇ—ｒａｎｋ检验法对组间的数据进行差异显著　性分析；计量资料采用完全随机设计方差分析；两　两比较采用ＳＮＫ检验分析，Ｐ≤０．０５表示差异有统计　学意义；所有统计学分析由ＳＰＳＳ　２０．０完成。　２结果　２．１　阴沟肠杆菌药敏结果及耐药基因的检测　微量肉汤稀释法证实，本研究所用的阴沟肠杆　菌临床分离株对亚胺培南耐药（ＭＩＣ＝８ｐｇ／ｍＬ）。该分　离株除对多黏菌素Ｂ敏感、对替加环素中介外，对亚　胺培南、庆大霉素、氨曲南、米诺环素、多西环素　等抗菌药物均耐药（表１）。ＰＣＲ扩增及琼脂糖凝胶电　泳表明该菌株是产ＶＩＭ金属酶的阴沟肠杆菌（图１）。　经测序鉴定该片段确为　因。　２．２不同的培养环境对于阴沟肠杆菌感染线虫的影响　有研究表明线虫的培养环境可以直接影响细菌　对线虫的感染效果［５］。为了探索构建阴沟肠杆菌．　线虫感染模型所需的最适培养环境，本研究在３种　不同的培养条件下研究阴沟肠杆菌感染后线虫的存　活情况。结果表明，相同的感染浓度下，线虫在　中国抗生素杂志２０１８年４月第４３卷第４期　表１　阴沟肠杆菌临床分离株的药敏试验结果　Ｔａｂ．１　Ｄｒｕｇ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　抗菌药物名称　ＭＩＣ结果判断　氨曲南　１　６ｇｇ／ｍＬ耐药　庆大霉素　６４ｇｇ／ｍＬ耐药　多西环素　６４ｐｇ／ｍＬ耐药　米诺环素　１６ｐｇ／ｍＬ耐药　亚胺培南　８ｇｇ／ｍＬ耐药　替加环素　４ｇｇ／ｍＬ中介　多黏菌素Ｂ　２ｐｇ／ｍＬ敏感　５　∞　如　∞　２　Ｍ：ＤＬ２，０００　ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；Ｎ：阴性对照；Ｐ：产碳青霉烯酶阴沟　肠杆菌　图１　ＰＣＲ扩增阴沟肠杆菌６肠、　基因　Ｆｉｇ．１　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ｂｌａｖＩＭ　ｇｅｎｅ　２０％ＢＨＩ—Ｍ９培养基中存活率最低　＝０．Ｏ１ｌ６＜０．０５），　而在１　０％ＢＨＩ．Ｍ９培养基和Ｍ９培养基中，阴沟肠杆菌　对线虫感染致死效果均不明显（图２）。　２．３产碳青霉烯酶的阴沟肠杆菌感染秀丽隐杆线虫　致死试验　在显微镜下观察未感染的正常线虫呈正弦运　动，并伴有口咽部的活动（图３Ａ）；而感染后的线　虫，其肠道膨胀，身体呈僵直不动的状态，无口咽　。．－２０％ＢＨＩ—Ｍｐ＋Ｅｃｌ　１０％ＢＨＩ　Ｍ９＋Ｅｃｌ　。．一　Ｍ９＋Ｅｃ１　。－＿　２０％ＢＨＩ．Ｍ９　１Ｏ　２Ｏ　３０　４０　感染后观察时间／ｌ１　图２不同培养条件对阴沟肠杆菌感染后线虫存活率的影响　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｎｅｍａｔｏｄｅｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　∞　秀　隐杆线虫一，　：碳ｆ　街烯怫…沟　感染ｆ；！，　ｌｎ矬市及应用　曹玲等　Ａ　Ｂ　；的活动（　３Ｂ）　他Ｈ］小ＪｌＪＪ浓度ｌ，ｆ勺Ｊ　碳１　烯嗍ｎ勺阴沟肠杆菌　感染线虫３６ｌ１Ｊ『　，观　线虫的　情　。存不同的　感染浓度（１　０　、ｌ　０　、ｌ０　、１　０　ＣＦｕ／ｍＬ干¨　白对照　组）下，线虫的　ｒ均仃活牢分圳／，ｊ７．２％、１　０．６６％、　１　０．４９ｔ／）０、２０％、１　００％（Ｉ冬Ｉ３Ｃ）。　照组卡¨比均　感染组　ｊｌｊ月性对　Ａ：　Ｉ＇ｌ－列　×１ｏ：Ｂ：　光　也×ｌ０：【’：　父比　也ｘ４０　‘统计学　片（３（　＝５３．６５，Ｐ＜０．０００１）。　图４　ｌｊ』ｊ沟肠卡ｆ　定ｆｆ【线虫的荧比，Ｊ÷跞　验　Ｆｉｇ．４　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｔｒａｃｉｎｇ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏｈａ（　ｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ｅｎｔｅｒｉｎｇ　．ｅｌｅｇａｎｓ　感染组ｌ　０　ｓ和ｌ　０４ＣＦＵ／ｍＬ十Ｈ比，线虫仃活率无显著　变化（Ｐ＝０．１　０２３＞０．０５）。　随着感染浓度的梯度升　高，感染纰ｌ０ｎＣＦＵ／ｍＬ　ｌ　０、１０５ＣＦＵ／ｍＬ梯瞍浓度　之『ｆＪＪ的线虫　活率十Ｈ比均　仃统汁　（）ｆ　＝７．６６４，　Ｐ＝０．００５＜０．０００１：　＝５．８０４，Ｐ＝０．０ｌ６＜０．０５）。　＾　Ｒ　感染＾　删臻【　｛ｊ　ｆｕ　Ｊ／ｈ　Ａ：感染ｌｊ“线虫ｆｎｊｆ；怠（１０×）：Ｂ：感　Ｊ　－虫ｎ勺Ｊ】；　各（１０×）；Ｃ　小旧菌｛　０阴沟肠十ｆ　：感染线虫盯线虫的　６＇－ｌｆ｛ｆ线　图３　０　川浓　沟Ｊｂ６￣ｔ‘　感染的秀｝ｊｆ｛隐十ｔ‘线虫ｌ，Ｉｉ仃曲线　Ｆｉｇ．３　Ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｃｕｒｖｅｓ　Ｏｒ　ｅｌｅｇａｎｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｎ‘ａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏ１）ａｃｔｅｌ‘（·，ｃＪ（７（　（７Ｐ　２．４线虫感染阴沟肠杆菌后细菌在体内的分布　为了　察线虫对　沟肠　：菌的摄取情况，本研　究将阴沟肠申ｒ　细胞膜标　红色荧光，埘照组加入　１ｍＬ　Ｎ，Ｎ一　｝『１　＿｛１酰胺，两组均　ｊ线虫共培养１２ｈ　后，ｊ｛｛荧）匕　微镜观察菌体　线虫·ｉ　的分　。结果　表叫，刈　照　线虫未出现荧光（罔４Ａ），　感染后的　线虫肠道内允满Ｊ　进食后标　了红色荧光的细菌，　导致肠腔膨胀（　４Ｂ～Ｃ）。　２．５线虫一产碳青霉烯酶的阴沟肠杆菌感染模型的初　步应用　小研宄选Ｈ义７种临床常　的抗菌药物，利用线　虫一阴沟肠补菌感染模　对药物的；ｆ『疗效果进行初步　验证。　据微景稀释　汤法测定的ＭＩＣ值确定用药　一一～　量。用药１２ｈ后，米　环素、彩　环索、竹Ｊ●　陌　●　，二＿●　ｈ　¨¨¨　¨¨　Ｊ口环素和　多黏菌素Ｂ均表现…明显的抗　治疗效　，但亚胺培　ｃ　∞　南、庆大蟊素、氨曲南埘陔十Ｉ０　！　九治疗效　（罔５Ａ）。　本研究进一步　：有效范　Ｉ内降ｆ　水讲　、多凸环　素、替ｌ『Ｊ几环素、多黏　紊Ｂ的药物浓瞍（　５Ｂ～Ｅ），发　现８１￣ｇ／ｍＬ米诺环素、３２ｐｇ／ｍＬ彩　采、０．５ｐｇ／ｍＬ　替加环素与对照组卡Ｈ比　经只仃Ｉ｛ＪＪ　的治疗效果（均　Ｐ＜０．０１），而多黏蔺豢Ｂ药物浓　低ｊ　２ｇｇ／ｍＬｔｔ￣失去　治疗效果（尸＝０．３５９８＞０．０５；｝冬ｌ５Ｅ）。垧』ＪＩ＿、【　胺培南、　氰　南、Ｊ犬大霉素的药物浓度（　５Ｆ、５Ｇ、５Ｈ）对线　虫的存活率无影响（尸＝０．６４２２；Ｐ＝０．２１　３；Ｐ＝０．９７７８，均　Ｐ＞０．０５）。总体来说，药物ｎ勺治　效　随　时问的延　长而下降ｆ图５）。　３讨论　『ｆｆ＝界卫卞组织（Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ＷＨＯ）　存２０１　７年　｝欠公　丫对人类健　戚ＩＪＪＪｊ、敲人的耐药　清单，其中碳青露烯类耐药的肠　化列第三，这　些耐药菌迫切需要新的抗生索治疗　‘法ｌ　Ｉ。而建立　高效、稳定、快速的药物筛选馍，　址　史　尚通量鉴　定新型抗耐约化合物或抗　Ｉｉ素的　础。秀　隐杆线　虫具有体积小、易培养、　观察、传代迷嫂快、与　人类　囚组高度　源等优势，近　米逐渐成为抗　药物筛选的经典模式牛物。ｆｉｔ】　线虫以　闲为食，　可以通过病原菌与线虫共培养，使细闲进入线虫肠　道内定植生长，从而影Ｉ响线虫的，ｆ　仃。｝＿　１ｎ仃研究者　已利用　些成熟的线虫感染卡；！　筛选Ｊｌ１』　仃特异性　抗菌能力的抗生素『７ｌ、抗菌肽　Ｉ、益　卜　ｌ　１或中药…１］　等，也为后续感染机制的研究奠定　础…Ｉ。　本研究１｛ｌ使用的秀　隐杆线虫为　ｔ　囚突变　株：．ｇ　一４是温度突变　，ｇ加一　，｝ｆ！；ｌ大ｌ突变ｆ　Ｊｌ导致线　虫存１　５℃产卵，２５℃不　卵。　此　ｉ２５。Ｃ裂解后得　到生长状况　致的线虫；ｓｅｋ一，足免疫突变　，该　基『大］突变后线虫更易感，能缩短建卡Ｉｌ所需的时间【１　２１。　本研究还采用液体培养批替代传统的…ｉ体培养基，　４４８　中国抗生素杂志２０ｌ８年４Ｊ　Ｊ第４３卷第４期　Ｂ　Ｃ　ＩＯＯ　一工　工　８（）　一萋６０　呈　一亚胺培南１６ｇｇ／ｍ　哑胺培南８ｇｇｔｍ［　Ｅ帻培南４；ａｇ／ｍ［　胺培南２１ａｇｉｍｌ　　　—Ｖｅｈｉｃｌｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｌ　ｌ　ｉ　●　０　２（）４０　６０　８０　§４ｏ　∽　２０　０　０　＝＝　２０　一　４０　６０　８０　治疗后观察Ｉ付问／ｈ　Ｆ　治疗后观察时间，ｈ　Ｌ　１　Ｌ　０　２Ｏ　４０　６０　８０　Ｏ　２（）４０　６Ｏ　８Ｏ　０　２０　４０　６０　８Ｏ　治ｊ　观察时问／ｈ　治疗后观察时间／ｈ　治疗后观察时间，ｈ　素６４１．ｔｇ／ｍＬ　素３２Ｂｇ／ｍＬ￣１６Ｂｇ／ｍｋ　ｋ￣８１－ｔｇ／ｍＬ　、。　素４ｇｇ／ｍＬ　素２ｇｇ／ｍＬ　素１ｇｇ／ｍｇ　素０　５ｇｇ／ｍＬ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　宝　２０　４０　６（）８０　Ｏ　２Ｏ　４０　６Ｏ　８０　治疗　观察Ｉｔ‘ｆ『ｉｌ］／ｈ　治疗后观察时ｌＮ／ｈ　Ａ：　川抗，卜采治疗阴沟肠杆菌感染后线虫，　存牢；Ｂ：庆大霉素；Ｃ：亚胺培南：Ｄ：氨曲南；Ｅ：米诺环紊；Ｆ：多黏菌素Ｂ；Ｇ：多西环　豢：Ｈ：惜ＤＩｌｌ：采　图５不同浓度的抗生素治疗阴沟肠杆菌感染后线虫的生存曲线　从而避免线虫往同体培养基上根据气味分辨并躲避　的具体浓度。当氨曲南、庆大霉素药物浓瞍提高至　５ｌ２ｇｇ／ｍＬ或亚胺培南提高至１６１ａｇ／ｍＬ仍未表现抗菌活　有害　芮ｆｉ　３１。将阴沟肠杆菌与线虫共培养后发现，　感染后的线虫自主　坛运动消失，口咽部活动丧　失，达到初步感染的状态…】。荧光示踪试验表明，　阴沟肠杆　定植于线虫的肠道内部，可能通过自身　性（均Ｐ＞０．０５），多黏菌素Ｂ的体外ＭＩＣ值为２￣ａｇ／ｍＬ，　而体内抗菌模型筛选的有效抑菌浓度也为２ｇｇ／ｍＬ，　表明了体内体外药敏结果相同，这与Ｃｏｎｅｒｙ等　］研究　的牛长和分泌毒素致使线虫死亡。本研究还发现阴　沟肠杆　感染线虫的最佳培养条件是２０％ＢＨＩ—Ｍ９培　芥　；通过感染条件优化实验，发现菌液浓度达到　ｌ０　、ｌ０　干【１ｌ０５ＣＦＵ／ｍＬｉｔ，］－均口Ｊ．以ｌ有效的感染线虫。为　Ｊ　快速何效地建　感染模型并减少菌体代谢产物对　线虫活性的影响，本研究选择ｌ０　ＣＦＵ／ｍＬ的感染浓　度进仃　续研究。　结果是一致。替加环素、米诺环素、多西环素在体　外药敏结果为耐药或中介，而相同浓度的药物在体内　感染模型中却表现出更好的抑菌效果（均Ｐ＜０．０５）。进一　步研究发现米诺环素（８ｇｇ／ｍＬ）、多西环素（３２ｇｇ／ｍＬ）、　替加环素ｆ０．５￣ｔｇｌｍＬ）达到相应浓度时己具有较好的　抗菌效果，这一结论与体外药敏试验并不一致。根　据２０１３年《替加环素体外药敏试验操作规程专家共　识》　】可知，在体外药敏试验中影响替加环素疗效　的干扰因素较多，因此体外药敏试验结果并不能很　使刖药物治疗感染后的线虫时，本研究发现　咳感染模型可以有效鉴定药物具有抗感染治疗效果　秀丽隐杆线虫．产碳青霉烯酶阴沟肠杆菌感染模型的建立及应用　曹玲等　４４９　好反应替加环素的抗菌性。这也表明线虫感染模型　在筛选有效抗菌药物中具有天然优势。药物可随着　线虫的进食进入肠道，使得药物在模拟人体内感染　环境下，更好的与细菌相互作用，从而发挥抑菌和　杀菌的效果。　２０１６，１　１（３）：１３５—１３９．　［８】　Ｊａｙａｍａｎｉ　Ｅ，Ｒａｊａｍｕｔｈｉａｈ　Ｒ，Ｌａｒｋｉｎｓ－Ｆｏｒｄ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｓｅｃｔ—　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｃｅｃｒｏｐｉｎｓ　ｄｉｓｐｌａｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｇａｉｎｓｔ　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｕｍａｎｎｉｉ　ｉｎ　ａ　ｗｈｏｌｅ－ａｎｉｍａｌ　ｈｉｇｈ—ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ　ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２０１５，５９（３）：　１７２８．１７３７．　本研究建立了秀丽隐杆线虫．耐碳青霉烯酶类阴　【９］　Ｋａｍａｌａｄｅｖｉ　Ａ，Ｂａｌａｍｕｒｕｇａｎ　Ｋ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　ｔｒｉｇｇｅｒｓ　ａ　ＴＬＲ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ＲＡＣＫ·１　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐ３８　ＭＡＰＫ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ　ｔｏ　ｒｅｓｉｓｔ　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　沟肠杆菌感染模型，并利用该模型筛选出具有明显　治疗效果的药物，为下一步探索阴沟肠杆菌感染线　虫的分子机制及新药筛选奠定了基础。　参考文献　刘琪，杨山虹，孙各琴，等．阴沟肠杆菌医院感染分布及耐　药性分析［Ｊ］．中国病原生物学杂志，２０１２，７（２）：１４９．１５１．　［２】　王丹，史红艳，李菁华，等．噬菌体对阴沟肠杆菌所致皮　下脓肿的抗感染研究［Ｊ］．中国微生态学杂志，２０１４，２６（１）：　ｌ４—１７．２２．　［３】　Ｊｅｏｎｇ　Ｓ　Ｈ，Ｌｅｅ　Ｋ，Ｃｈｏｎｇ　Ｙ’ｅｔ　ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｉｎｔｅｇｒｏｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＶＩＭ－２，ａ　ｍｅｔａｌｌｏ－ｂｅｔａ—ｌａｃｔａｍａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｃａｓｓｅＲｅ，ｉｎ　ａ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ［Ｊ］．Ｊ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００３，５１（２）：３９７－４００．　［４］　Ｃｏｈｅｎ　Ｌ　Ｂ，Ｔｒｏｅｍｅｌ　Ｅ　Ｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｈｏｓｔ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｅｍａｔｏｄｅ　Ｃ　ｅｌｅｇａｎｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，　２０１５，２３（２）：９４－１０１．　［５］　周雨朦，陈代杰，李继安，等．秀丽隐杆线虫．耐药铜绿假　单胞菌感染模型的建立［Ｊ］．中国抗生素杂志，２０１１，３６（７）：　５１　１－５１４．５６５．　［６】　Ｗｉｌｌｙａｒｄ　Ｃ．Ｔｈｅ　ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｈｔａｔ　ｐｏｓｅ　ｔｈｅ　ｇｒｅａｔｅｓｔ　ｈｅａｌｔｈ　ｔｈｒｅａｔｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，７６４３（５４３）：１５．　［７］　毕爽，胡淦海，胡丹丹，等．秀丽隐杆线虫一白念珠菌感染　模型用于抗真菌药效评价的研究［Ｊ］．中国真菌学杂志，　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ＆Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２０１６，７（７）：３２１１－３２２３．　【１０］Ｗａｎ　Ｆ，Ｚｈｉ　Ｄ，Ｌｉｕ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｌｉｆｅｓｐａｎ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ　ｂｙ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｆｏｒｍｕｌａｓ／ＪＪ．Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌ，２０１４，１５（４）：３７７—３８７．　［１　１］Ｚｈａｎｇ　Ｊ，Ｈｏｌｄｏｒｆ　Ａ　Ｄ，Ｗａｌｈｏｕｔ　Ａ　Ｊ．Ｃ　ｅｌｅｇａｎｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｄｉｅｔ　ａｓ　ａ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｓｙｓｔｅｍｓ—ｌｅｖｅｌ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｈｏｓｔ－ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１７，　４６（２）：７４－８０．　【１２１陈丽红，孙利芹，王长海．利用秀丽隐杆线虫构建抗菌物　质体内筛选模型［Ｊ］．烟台大学学报（自然科学与工程版），　２０１２，２５（２）：１１７－１２１．　［１３］Ｅｗｂａｎｋ　Ｊ　Ｊ．Ｔａｃｋｌｉｎｇ　ｂｏｔｈ　ｓｉｄｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｏｓｔ－ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂ　Ｉｎｆｅｃｔ，　２００２，４（２）：２４７—２５６．　ｆｌ４１王讯，孙树梅，欧阳妮，等．秀丽隐杆线虫．泛耐药肺炎　克雷伯菌感染模型的建立［Ｊ］．中国感染控制杂志，２０１６，　ｌ　５（７）：４５７－４６０．　［１５】Ｃｏｎｅｒｙ　Ａ　Ｌ，Ｌａｒｋｉｎｓ—Ｆｏｒｄ　Ｊ，Ａｕｓｕｂｅｌ　Ｆ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｈｉｇｈ—　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｆｏｒ　ｎｏｖｅｌ　ａｎｔｉ—ｉｎｆｅｃｔｉｖｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｅ　ｅｌｅｇａｎｓ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｐｒｏｔ　Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ，２０１４，　６（１）：２５—３７．　［１６１王辉，俞云松，王明贵，等．替加环素体外药敏试验操作规　程专家共识［Ｊ］．中华检验医学杂志，２０１３，３６（７）：５８４．５８７．