免疫组化方法检测细小病毒在雏鹅体内分布规律研究

６　甘肃畜牧兽医　２０１２年３（总２２４）期　免疫组化方法检测细小病毒在雏鹅体内　分布规律研究　杨静红　，李广兴　（１．山东工商学院，山东烟台２６４００５；２．东北农业大学）　摘要：采用间接免疫酶组织化学染色法对１４日龄雏鹅人工感染ＧＰＶ后，不同时间段病毒抗原在　体内的定位及分布情况进行了检测。同时应用图像分析软件对抗原染色强度进行了定量分析。结　果显示，感染后第１天到第２１天的不同时间点可以从心脏、肺脏、脾脏、肝脏、法氏囊、胸腺、腺胃、十　二指肠、空肠、回肠、盲肠、食管十二种组织器官检测到病毒抗原。其中感染第５天感染组织最广泛，　抗原染色强度最强，在检测的组织中空肠的检出率最高。病毒抗原广泛分布于肠道的上皮细胞、腺　上皮细胞，肺泡壁细胞和肾小管的上皮细胞内，可见上皮细胞为ＧＰＶ抗原的主要靶细胞。始终未能　从大脑、胰腺和骨骼肌检测到ＧＰＶ。　关键词：鹅细小病毒；间接免疫酶组织化学法；染色强度；分布规律　中国图书分类号：ｓ　８５２．６５　９．２文献标识码：Ａ文章编号：１００６￣７９９Ｘ（２０１２）Ｏ３—０ｏ０６—０３　鹅细小病毒（ｇｏｏｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＧＰＶ）属于　细小病毒科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｔｅ）细小病毒属（Ｐａｒ．　１４日龄无母源抗体的未免疫雏鹅５６只　购于哈尔滨郊区一养殖户。　ｖｏｖｉｍｓ　Ｇｅｎｕｓ），由该病毒引起的疾病称鹅细　小病毒病，又名小鹅瘟或Ｄｅｒｚｓｙ’ｓ病　（Ｄｅｒｚｓｖ．Ｄ等，１９６７），是仅感染雏鹅和番鸭　的传染性疾病。本病主要感染出壳后３～２０　日龄的雏鹅。近年来，小鹅瘟的发病和流行　趋势出现了一些与以往不同的新特点，我国　学者（朱有文，２００４）报道了小鹅瘟的发病情　况出现延后的现象。所以针对１０日龄以上　的雏鹅感染该病后病毒抗原分布规律进行研　究是十分必要的。　１　试验材料　１．１　试验毒株　ＧＰＶ　ＨＩ中强毒株由东北农业大学免疫　１．３　主要仪器　全自动制冰机Ｎ一３５８　ＢＩＯ—ＲＡＤ公司；　Ｎｉｃｋｏｎ　２４０ｏ显微镜及数码显微照相系统　（Ｎｉｋｏｎ公司）；电热恒温水温箱ＷＳＺ一２６１一　７９型；图像分析系统Ｎｉｋｏｎ公司，日本。　１．４　主要生物制剂和化学试剂　兔抗ＧＰＶ的ＩｓＧ，东北农业大学免疫微　生物教研室惠赠；过氧化物酶标记的链酶卵　白素（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ／Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＳＰ）免疫组织　化学染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术　有限公司，批号ｓＰ一９００２；胰蛋白酶（ｔｒｙｐ一　ｓｉｎ）购于上海化学试剂站分装厂；３，３一二氨　基联苯二胺盐酸盐（ＤＡＢ）显色试剂盒购于　微生物教研室惠赠。　１．２试验动物　上海试剂一厂；多聚赖氨酸购于武汉博士德　生物工程公剧。　２　试验方法　作者简介：杨静红（１９８１一），女，硕士。　为通讯作者。　２．１　试验动物分组和病毒接种试验　５６只１４日龄无母源抗体雏鹅随机分为　研究报告　７　２组，对照组ｌ６只、ＧＰＶ感染组４Ｏ只。其　中，感染组每只雏鹅肌注０．１　ｍＬ、口服　０．５　ｍＬＧＰＶ尿囊液；对照组雏鹅肌注　０．１　ｍＬ、口服０．５ｍＬ生理盐水。　２．２样品的采集　果阴性表示为（一）（邢传平等，２００１）。　２。５　免疫酶组织化学方法检测ＧＰＶ在雏鹅　体内分布规律的研究　按照２．３的方法对试验组、对照组雏鹅　ＧＰＶ感染后第１、３、４、５、６、７、１４、２１天进　采取的所有组织进行试验。显微镜下观察结　果，并照相。　行剖杀取材，每次感染组随机抽取５只雏鹅，　对照组取２只，分别心脏采血处死，快速采取　心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空　肠、回肠、盲肠、胸腺、法氏囊、腺胃、胰腺、大　脑、骨骼肌等组织器官放于塑封袋中。采取　的所有病料作好标记后迅速置于一２ＯｃＩ＝　保存。　２．３检测ＧＰＶ在雏鹅体内分布的免疫组化　方法　采用以优化好的间接免疫酶组织化学方　法，具体操作如下：冰冻切片６０，ｍ，以多聚赖　氨酸为粘片剂，８０％的冷丙酮固定３０　ｍｉｎ，　ＰＢＳ（０．０１　ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．４磷酸盐缓冲液）洗涤　切片，用３％的过氧化氢温箱中孵育２０　ｍｉｎ。　ＰＢＳ洗涤切片，０．０５％的胰蛋白酶修复　８ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤切片，５％一１０％正常山羊血　清封闭，温箱中孵育２０ｍｉｎ，倾去血清，勿洗。　滴加１５０倍稀释的一抗，４￣Ｃ过夜，ＰＢＳ洗涤　切片，滴加ｌ５倍稀释二抗，３７℃孵育６０　ｍｉｎ。　滴加５Ｏ　辣根酶标记链酶卵白素，３７℃孵　育４０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤切片，ＤＡＢ显色１　ｍｉｎ，蒸　馏水洗，用苏木素做核复染，盐酸酒精分化１　～２　ｓ，自来水返蓝１～２ｈ。电风扇吹干或温　箱烤干，二甲苯透明，树胶封片。　２．４结果的判定　ＤＡＢ显色阳性部位呈棕黄色颗粒，特异　性好，无背景染色。阳性结果的判定标准为：　阳性细胞数≤２５％表示为（＋），２５％一５０％　表示为（＋＋），＞５０％表示为（＋＋＋）；再　结合染色强度，棕黄色表示为（＋），较深棕　黄色表示为（＋＋），极深的棕黄色表示为　（＋＋＋）。疑似阳性结果表示为（±）。结　２．６免疫酶组织化学方法检测ＧＰＶ在雏鹅　体内分布的定量研究　应用Ｉｍａｇｅ—Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ５．２软件对染色阳　性强度进行检测，染色强度值越高，表明阳性　反应越强，结果以平均数和标准差（Ｘ－Ｉ－．ｓ）表　示（张瑞丽，２００６）。　３结果与分析　３．１　人工感染ＧＰＶ后不同时间器官组织病　毒抗原的动态分布　对检测组织免疫酶组织化学染色后切片　在电子显微镜下观察，结果总结如下：１４　１３　龄雏鹅经肌注和口服同时感染ＧＰＶ后，第１　天即能在心脏、肺脏、脾脏、法氏囊、胸腺、腺　胃、十二指肠、空肠和回肠中检测到病毒存　在。感染第３天检测组织数开始增加，除以　上组织外还能在肝脏和盲肠中检测到病毒存　在。持续到第５天食管中开始能检测到病　毒存在。第６天肝脏中检测不到病毒存在。　感染第７天感染组织开始减少，肝脏和盲肠　检测不到病毒存在。感染第ｌ４天阳性组织　数明显减少，仅能在空肠、胸腺和食管中检测　到病毒存在。感染后第２ｌ天，除空肠外所有　被检测组织内均未检测到病毒抗原。而大　脑、胰腺和骨骼肌始终没有检测到病毒的　存在。　３．２感染雏鹅主要器官组织病毒抗原强度　定量的动态变化　染色阳性的切片应用Ｉｍａｇｅ—Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ５．２软件对染色强度进行分析，结果总结　如下。　免疫器官：脾脏在感染后第６天抗原强　度最高，而法氏囊在感染后第５天，胸腺在第　８　甘肃畜牧兽医　２０１２年３（总２２４）期　７天抗原强度达到最高。　消化器官：肝脏从感染后４　ｄ抗原强度　明显高于其他１３龄。腺胃感染后第６天抗原　强度最高，食管感染后第７天抗原强度最高。　肠道组织：十二指肠和空肠在感染后第　７天抗原强度明显高于其他日龄，回肠在感　身各部位，最后定居在肠道，从试验结果来　看，空肠可能是其主要的定居部位。这可以　用来解释临床上空肠出现特征性的“香肠样　栓子”的病理学原因。始终未从大脑、胰腺　和骨骼肌中检测到病毒抗原，可能是由于这　些部位的细胞胞浆不适合该株病毒复制。　染后第６天、盲肠在感染后第５天抗原强度　达到最高。　其他组织：心脏第５天抗原强度明显高　于其他日龄，肺脏在感染后６ｄ抗原强度明　显高于其他日龄，肾脏组织在感染后６日龄　抗原强度最高。　３。３对照组　对照组免疫组化染色的结果为阴性。　４　讨论　本试验首次对国内一株ＧＰＶ中强毒株　感染无母源抗体的１４日龄雏鹅器官组织内　病毒抗原的动态分布进行研究，结果显示，雏　鹅感染ＧＰＶ后，大部分组织器官血管内皮细　胞实质细胞及炎性细胞（主要为吞噬细胞和　淋巴细胞）的胞核内均可检测到病毒抗原，　其时间从感染后１　ｄ持续到１４　ｄ，空肠持续到　２１　ｄ。研究中肠道和肺脏的阳性率较高。除　消化道的上皮细胞和固有层腺体上皮细胞胞　核内出现大量的病毒外，肠道内的内容物以　及肠道上皮细胞表面纹状缘中也能检测到病　毒，而且病毒存在时间较长，由此可见若感染　动物不死亡就会通过消化道和呼吸道不断地　向外排毒。再加上感染雏鹅机体的免疫系统　受到了侵害，此时机体对病原微生物的抵抗　能力下降，更容易引起大流行。　对主要器官组织抗原染色强度的动态变　化进行比较研究，结果发现，感染后第７天　空肠的病毒抗原染色强度明显高于其他组　织。这可能是由于病毒进人机体后，虽然消　化系统是其主要攻击的部位，但是病毒在机　体各个部位的分布有可能是通过循环系统实　现的，病毒进入机体后首先损害白　器官是　心脏和肺脏。最后病毒随着血液循环到达全　从不同时间的检测情况可以看出，１４日　龄雏鹅经口服和肌注同时感染ＧＰＶ后，病毒　在雏鹅体内大部分组织均有分布，分布最为　广泛的时间段为感染后的５～６　ｄ。组织抗原　染色强度显示，在感染后的第５天染色强度　明显高于其他时间段。这与相关报道（周春　宇等，２００５；黄诚等，２００４）比较，病毒在体内　的分布范围相对低，对组织器官的损害程度　小，病毒在雏鹅体内存在的时间相对短。可　能是由于随着雏鹅日龄的增加，雏鹅的免疫　系统逐渐完善，机体的抵抗力增强。以及病　毒进入机体后刺激机体的免疫系统，激发体　液免疫，产生抗体，病毒在雏鹅体内复制受到　抑制结果。已有研究表明，雏鹅感染ＧＰＶ　后，体液免疫起主要作用。　参考文献　［１］Ｄｅｒｚｓｖ．Ｄ．ａｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａ．ｖｉｒａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｏｆ　ｇｏｓｌｉｎｇｓ［Ｊ］　．Ａｃｔａ　Ｖｅｔ　Ｈｕｎｇ，１９６７（１７）：４４３—４４８．　［２］朱有文．小鹅瘟发病日龄延后［Ｊ］．中国禽业导　刊，２００４（２１）。２５．　［３］邢传乎，刘斌，董亮．免疫组织化学标记结果的判　定方法［Ｊ］．中华病理学杂志，２００１，３０（４）：３１８．　［４］张瑞丽．ＨＳＮ１亚型禽流感病毒对雏鸡致病机制　的研究［Ｄ］．哈尔滨：东北农业大学，２００６．　［５］周春宇，程安春，汪铭书，等．间接免疫酶组织化　学检测雏鹅人工感染鹅细小病毒后病毒在体内动态分布规　律的研究［ｃ］．第六届全国会员代表大学暨第１１次学术研　讨会论文集，２００５：８０４—８０７。　［６］黄诚，程安春，汪铭书．鹅细小病毒强毒ＰＣＲ检　测方法的建立［Ｊ］．中国兽医科技，２００４，３４（９）：１０２—１０６．　［７］ｌｅｅ　Ｊｗ，ｎｎ　Ｙｕ—ｒｕｉｎｇ，Ｙｅｎ　ＴＹ，ｄ口Ｌ　ＣｐＧ　ｏｌｉ—　ｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＧＡＣＧＴｒ　ｍｏｆｉ￣ｅｕｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ｉｍ—　ｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｅｌｉｃｉｔｅｄ　ｂｙ　ａ　ｇｏｏｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｉｎ　ｄｕｃｋｓ　［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１０。２８（５０）：７９５６—７９６２．　［８］Ｚｈｕ　Ｌ　Ｑ，Ｄｉｎｇ　Ｘ　Ｙ，Ｔａｏ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｆｏ　ｔａｒｇｅｔ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　Ｇｏｏｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｒｇａｎｓ［Ｊ］．Ａｃｔｓ　Ｖｉｒｏ！，２０１０，５４（３）：２１ｌ一２１５．