荧光定量PCR检测硬蜱体内莱姆病螺旋体的研究

2020-10-02 来源：爱go旅游网

畜牧与兽医　2010年　第42卷　第1期・23・

曹　杰,仝彩玲,周勇志,张厚双,周金林

(中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室,上海　200241)

摘要:为建立一个荧光定量PCR检测硬蜱体内莱姆病螺旋体的方法,根据GenBank登录的莱姆病螺旋体鞭毛蛋白FlaB序列,应用生物学软件进

行序列比对,在保守的C段区设计与筛选特异引物和TaqMan探针。对荧光定量PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性,并通过对感染螺旋体的蜱样本的检测,评价该方法的实用价值。结果显示,自然感染莱姆病螺旋体的35份蜱标本检测阳性符合率100%,正常蜱20份标本的检测结果均为阴性。该方法对牛巴贝斯原虫、泰勒原虫、边缘无浆体、金龟子绿僵菌、大肠杆菌等蜱体常见病原微生物所抽提的DNA的检测均呈阴性。荧光定量PCR方法检测质粒的灵敏度可达1×102拷贝/μL。TaqMan荧光定量PCR方法检测硬蜱体内莱姆病螺旋体具有较好的敏感性和特异性,可适于莱姆病的流行病学调查和监控。

关键词:硬蜱;莱姆病;伯氏疏螺旋体;荧光定量PCR

中图分类号:S85217　　　文献标识码:A　　　文章编号:052925130(2010)0120023203DetectionofBorreliaburgdorferiintickbyareal2timefluorescence

quantitativePCR

CAOJie,TONGCai2ling,ZHOUYong2zhi,ZHANGHou2shuang,ZHOUJin2lin

(ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,CAAS,KeyLaboratoryofAnimalParasitologyofMinistryofAgricultureofChina,Shanghai200241,China)

Abstract:Toestablishareal2timefluorescencequantitativePCRassayfordetectingBorreliaburgdorferiintick,accordingtothepublished

flagellingenesequencesofB1burgdorferi,amultiplesequencealignmentwasdonetosearchforprimersandthefluorogenicTaqManprobe.Thesensitivityandspecificityofthereal2timePCRassaywereconfirmedusingtheinfectedticksamples.Theresultsshowedthatallthe35samplesfromtheinfectedtickswerepositive,whereas20normaltickswereallnegative.Thesampleswithotherpathogens,suchasBabesiabovis,Theileriaannulata,Anaplasmamarginale,MetarhiziumanisopliaeandEscherichiacoli,werenegative.Thesensitivityofthereal2time

μLofrecombinantplasmid.Takentogether,wehaveestablishedareal2timePCRassayfordetectionofpatho2PCRassaywas1×10copies/

genforLymediseaseintick.ThisassaywillbeusefulintheinvestigationandcontrolofLymedisease.

Keywords:tick;Lymedisease;Borreliaburgdorferi;real2timePCR

　　莱姆病是由蜱传播的一种新发现的人畜共患传染病,其病原体为伯氏疏螺旋体。1975年在美国康涅狄克州莱姆镇的患病儿童中发现,并因此得名。1982年从蜱中分离出螺旋体,证实为莱姆病的病原(Steere等,1977;Burgdorfer等,1982)。目前,我国已有20多个省、市、自治区发现有此病的分布及报告,其危害已日益受到人们的关注

[1-2]

。目前对莱

姆病病原在哺乳动物宿主阶段检测技术研究较多,但蜱体阶段的检测研究很少。蜱属于节肢动物门蜘蛛纲动物,是一类最常见的动物体表寄生虫,侵袭包括人在内的多种宿主,广泛分布于世界各地,具有复杂的

收稿日期:2009208226

基金项目:上海市科委标准化专项(07DZ05028)。作者简介:曹杰(19702),男,副研究员,学士。3通讯作者。

生活史和很高的繁殖率,因此媒介蜱体内的病原体检测研究对于莱姆病的预警和防治是一个重要的环节。

目前,蜱体内的病原体检测,国内外零星的报道主要是显微镜检查、动物接种和常规PCR检测方法,但上述方法均存在一定的缺陷。显微镜检查具有简便、准确等优点,但蜱体阶段的病原体数量少,形态复杂,易造成误诊或漏诊。动物接种时间长而且不稳定。聚合酶链反应(PCR)具有特异、敏感、快速等优点,但常规PCR方法在实际应用中仍存在诸多不足之处,例如,DNA聚合酶容易被组织和血淋巴液

[4-5]

来源的抑制剂等灭活,从而出现假阴性;而由于污染出现假阳性则更为常见。荧光定量PCR技术,融汇了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点,通过直接探测PCR过程中荧光信号的变化,以获得定量的结果,不需要

[3]

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PCR后处理或电泳检测,完全闭管操作(整个过程

中仅有加入样品的一次开盖),克服了常规PCR技术的诸多难题。因此,该技术在病原的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定上都开始得到应用,并开始形成若干病原微生物荧光定量PCR检测的标准技术。荧光定量PCR技术检测蜱体内的莱姆病病原体尚未见报道。

常数为6102×10,一个碱基对的平均分子量为648,重组质粒的总长度为4026(3015+1011)bp,标准品作10倍梯度稀释。用紫外分光光度计测定阳性质粒的OD值,计算其浓度,并依次稀释成含质粒数量

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分别为10、10、10…10、1个拷贝共9个样品梯度作为标准品,-40℃保存备用。117　实时荧光定量PCR检测方法的建立

反应体系总体积为20μL,其中PremixEx2Taq10μL,ROXRefernceDyeII014μL,F1012μmol/L,R1012μmol/L,探针溶液013μmol/L,DNA模板2μL,余下用水补足。反应条件为:95℃30s,一个循环,然后95℃5s,60℃30s,共40个循环,在ABIPRISM7900HT荧光定量PCR仪进行。反应结束后,对获得的信号、数据进行处理,以获得各样品和标准品的数据。118　标准曲线的建立

将已知拷贝数的质粒做10倍系列稀释作为模板,进行荧光定量PCR扩增,得到相应的动力学曲线,并计算产生相应的标准曲线。119　特异性试验

以自然感染莱姆病螺旋体的35份蜱标本,正常蜱20份标本以及牛巴贝斯原虫、泰勒原虫、边缘无浆体、金龟子绿僵菌、大肠杆菌等蜱体常见病原微生物所抽提的DNA为模板和双蒸水进行Real2timePCR检测,测定该检测方法的特异性。1110　敏感性试验

将上述重组质粒做倍比稀释,并用相应的引物探针进行Real2timePCR扩增,测试其灵敏度。

1　材料与方法

111　莱姆病螺旋体

　　引自军事医学科学院流行病学研究所,从吉林一患者体内分离。112　蜱采自吉林延边黄牛体表的半饱血成蜱,经鉴定为长角血蜱。试验蜱解剖后,取部分中肠研磨,用BSK培养基培养,显微镜观察确定感染阳性,其他部分按试剂盒方法提取DNA,用于荧光定量PCR检测模板。113　试剂

pGEM2TEasysystemⅠ为Promega公司产品,DNA胶回收试剂盒、小质粒抽提试剂盒购自上海赛

百盛生物工程有限公司。PremixEx2Taq、dNTP、DNAMarker均为宝生物工程(大连)有限公司产品。114　螺旋体鞭毛蛋白FlagelinA基因的克隆

根据莱姆病螺旋体B31标准株的鞭毛蛋白Flage2linA序列设计一对PCR扩增引物,上游:5′2ATGATTATCAATCATAATACATCAGCTA23′;下游:5′2TTATCTAAGCAATGACAAAACATATTGG23′。

以本实验室引进培养的螺旋体基因组DNA为模版,

α,扩增该基因序列,通过T2载体连接,转化到DH5重组质粒经测序分析鉴定。

115　引物与探针

根据GenBank登录的的螺旋体鞭毛蛋白FlaB序列(X15661),应用生物学软件进行序列比对,在保守的C段区,设计的引物F1、R1和TaqMan探针,探针5′端标记的荧光报告基团为FAM,3′端标记的淬灭基团为TAMRA。引物和探针由上海生物工程技术服务有限公司合成。具体序列为,F1:5′2AGCAAATTTAGGTGCTTTCCAA23′;R1:5′2GCAATCATTGCCATTGCAGA23′;探针:FAM2TGCTACAACCTCATCTGTCATTGTAGCATCTTTTATTTG2TAMRA。

116　标准品浓度的计算

2　结果与分析

211　重组阳性质粒的构建和标准曲线的建立

　　应用PCR方法成功从吉林株莱姆病螺旋体扩增

出特异的基因,回收的PCR产物经过连接、转化后克隆到pGEM2T载体中,挑取单菌落进行培养后抽提质粒,重组质粒经测序鉴定为含FlagelinA基因的重组质粒。

用标准质粒样品进行扩增,得出了一条标准曲线,斜率为-4105,截距为4319,从而可以得出拷贝数(Copynumber)与循环阈值(Ct)之间的线性关系曲线表达式:Ct=-4105lgCopynumber+4319,而待测样品的Ct值可以从仪器中读取;把待测样品的Ct值代入表达式就可以算出它的初始拷贝数。从

建立的标准曲线可知,相关系数R=01997,表明该试验误差较小,该标准样品为荧光定量的标准品是合格的(见图1)。

将上述质粒做100倍稀释后,用紫外分光光度计测定其浓度,然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数:拷贝数=质粒浓度×体积×阿氏常数÷(一个碱基对的平均分子量×质粒的总长度),其中,阿氏

畜牧与兽医　2010年　第42卷　第1期・25・

水进行Real2timePCR检测。结果显示,体外培养的

螺旋体样本、自然感染莱姆病螺旋体的35份蜱标本检测阳性符合率100%,正常蜱20份标本的检测结果均为阴性,对牛巴贝斯原虫、泰勒原虫、边缘无浆体、金龟子绿僵菌、大肠杆菌、双蒸水检测结果均无荧光产生,证明该方法在莱姆病螺旋体样品的检测中有很好的特异性。

3　讨论

实时荧光定量PCR准确检测样品的前提是选择标准品和制作标准曲线。理想的标准品应与样品具有

[6]

高度的同源性,同时有较好的稳定性。制作标准曲线要注意对标准品的准确稀释。本试验选用纯化好的阳性质粒作为标准样品,且选用了10个稀释度的样品进行荧光定量PCR扩增,发现起始浓度越高,Ct值越小,因此起始浓度与Ct值之间具有很好的线性关系。

本试验建立的荧光定量PCR方法对体外培养的螺旋体、感染的蜱以及牛巴贝斯原虫、泰勒原虫、边缘无浆体、金龟子绿僵菌、大肠杆菌、双蒸水进行荧光PCR,结果体外培养的螺旋体、感染的蜱检测均为阳性,而牛巴贝斯原虫、泰勒原虫、边缘无浆体、金龟子绿僵菌、大肠杆菌、双蒸水结果为阴性,证明所建立的荧光定量PCR方法具有较好的特异性。本试验成功建立了TaqMan实时荧光定量PCR方法,为今后蜱体莱姆病螺旋体的研究提供了一项先进的检测技术。对于螺旋体的含量和疾病发生的相关性,以及对螺旋体的监测等研究均可采用此方法获得准确的定量数据。

图1　用标准阳性质粒制作的标准曲线

212　荧光定量PCR结果分析与判断21211　质控标准

　　阳性样品对照应小于3010,并出现典型扩增曲线。阴性样品无Ct值或无扩增曲线。否则,此次试验视为无效。

21212　结果描述与判断

阴性样品无Ct值或无扩增曲线,表示样品中莱姆病螺旋体;阳性样品Ct值小于或等于3010,且出现典型扩增曲线表示样品中有莱姆病螺旋体(图2);有效原则Ct值大于3010的样品建议重做。重做结果无数值者为阴性,否则为阳性。

参考文献:

[1]　张哲夫,万康林,张金声,等.我国莱姆病的流行病学和病原

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[2]　万康林,张哲夫,张金声,等.中国20个省、区、市动物莱

姆病初步调查研究[J].中国媒介生物学及控制杂志,1998,

图2　阳性样品的典型扩增曲线

5(9):3662368.

[3]　SonenshineDE.BiologyofTicks,Vol1Ⅰ[M].Oxford:Oxford

UniversityPress,1993:125.

213　荧光定量PCR敏感性试验

[4]　AkaneA,MatsubaraK,NakamuraH,etal.Identificationofthe

将标准质粒做倍比稀释,分别稀释成10、10、

6210

μL,并用相应引物探针在10…10、10和10拷贝/

ABI7900荧光定量仪上进行检测,荧光定量PCR方

μL。法检测质粒的灵敏度可达1×10拷贝/

214　荧光定量PCR特异性试验

对体外培养的螺旋体、感染的蜱及正常的蜱、牛巴贝斯原虫、泰勒原虫、边缘无浆体、金龟子绿僵菌、大肠杆菌所抽提的DNA或cDNA为模板和双蒸

hemecompoundcopurifiedwithdeoxyribonucleicacid(DNA)frombloodstains,amajorinhibitorofpolymerasechainreaction(PCR)amplification[J].JForensicSci,1994,39:3622372.

[5]　Al2SoudWA,J󰂪nssonLJ,R󰂝dstr󰂪mP.Identificationandcharac2

terizationofimmunoglobulinGinbloodasamajorinhibitorofdiag2nosticPCR[J].JClin.Microbiol,2000,38:3452350.

[6]　StoneB,BurrowSJ,SchepetiukS,etal.Rapiddetectionandsim2

ultaneoussubtypedifferentiationofinfluenzaAvirusesbyreal2timePCR[J].JViroMethods,2004,117(2):1032112.

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