海洋放线菌#A34和真菌#1942活性成分研究
彭虹1 王立，林永成2*
中山大学化学与化学工程学院， 广州 510275
摘要 海洋环境十分独特，极端的生态环境必然赋予生存于其中的海洋微生物不同于陆生微生物的独特的遗传背景和生理性能，并使其发展出独特的代谢方式，因而为寻找海洋新型生物活性物质提供了潜在的丰富的源泉。本文阐述了海洋放线菌和海洋真菌代谢产物研究的意义和研究进展。
实验部分对放线菌#A34和真菌#1942的代谢产物进行分离鉴定，得到7个化合物，其中包括从南海真菌#1942发现，价格昂贵，有细胞毒性的sterigmatocystin，其含量高达约1g/100L ,有可能开发成为资源菌。
关键词 代谢产物 海洋放线菌 海洋真菌
一 引言
海洋，占地表总面积71%，是独特生态系统工程的微生物的生存繁衍地。由于海洋环境的特殊性和微生物独特的遗传背景，海洋微生物已发展出不同于陆地微生物的独特代谢方式，因而为寻找海洋新型生物活性物质提供了潜在的丰富的源泉。
研究海洋微生物代谢产物不仅能够从中寻找新的抗生素和抗病毒等活性物质，在维护人类健康方面有着重要意义；而且用工业发酵生产可减少污染、节约能源、降低成本、提高产量，从而实现可持续发展。
二 海洋放线菌和真菌的研究情况
2.1 海洋放线菌的研究情况
放线菌（Actinomycetes）是一大类具有分枝状菌丝体的革兰氏阳性菌，最早由Cohn（1875）由人泪腺感染病灶中分离到一株丝状病原菌——链丝菌（streptothrix）而发现的。由于Waksman（1943）和其他研究者的创造性工作，陆续放线菌的一些种中分离到氯霉素、四环素、新霉素和红霉素等。从此，放线菌作为抗生素和其他生物活性次生代谢产物的重要微生物资源而越来越受到人们的关注。目前世界药物市场上的67%的抗生素产品来自微生物，其中2/3又是放线菌所产生（Newman and Laird,1997）。
海洋放线菌代谢产物类型丰富，有内酯类、吡喃酮类、醌类、生物碱类、肽类、酰胺类等化合物。如Masashi Tsuda 等[1]从放线菌 brasiliensis IFM 0955中分离到一个新的大环内酯类抗生素，命名为Brasilibactin A，对微球菌和葡萄球菌有抑制活性(MIC 0.73 and 4.5 mg/mL, respectively)，而且对人体表皮癌细胞有很强的体外细胞毒作用(IC50, 0.04μg/mL)；Scott S. Mitchell等[2]从海洋沉积物样品分离到的链霉菌aureoverticillatus NPS 001583中发现了结构新颖
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基金项目 中山大学化学与化工学院第五届创新化学实验基金项目（批准号：31）资助； 第一作者 彭虹（1983年出生） 中山大学化学与化工学院化学系01级化学专业。 2
指导老师 林永成 E-mail:ceslyc@zsu.edu.cn 王立 博士,中山大学化学与化工学院02级有机化学专业。
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的22元环内酰胺，命名为Aureover -ticillactam，对直肠癌细胞、黑素瘤、急性白血病T细胞等均有适中的EC50值。
放线菌除了是寻找和发现天然生物活性物质的重要生物资源外，也是环境污染生物治理中值得重视的重要生物类群。它们可用于降解橡胶制品，处理活性污泥，以及工业发酵生产。
2.2 海洋真菌的研究情况
海洋真菌的分布极为广泛，可从来源于海洋的不同的基质中找到,如红树林的树干、树叶、气根、海藻、海洋漂浮的木头、海水浸泡的沼泽地、死亡的珊瑚、海洋沙滩种植物、海底沉积物，海洋中各种动物的体内，体表的共生真菌等[3]。海洋真菌代谢产物类型包括杂环类、环肽类、生物碱类、肽类、酮类、萜类等化合物。如日本Sankyo研究小组[4]从海洋担子菌deuteromycete Phoma sp.分离的到phomactin A可以作为新型的血小板活化因子拮抗剂。
三 海洋放线菌#A34和真菌#1942活性成分的研究
3.1 实验试剂与仪器
葡萄糖CP，蛋白胨BR，酵母膏BR，粗海盐（微生物养殖用），其它实验用试剂均为市售AR试剂。薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂生产的硅胶G、GF254、H、HF254，柱层析硅胶为青岛海洋化工厂生产的200-300目硅胶及硅胶H。
核磁共振仪(Varian，INOVA-500)；红外光谱仪（Bruke，EQUINOX55-A590/3F）；显微熔点仪（北京物理光学仪器厂，X4型）；质谱仪（VG，ZAB-HS）；元素分析仪器（Elementar，Vario EL CHNS-O）。
3.2 菌种和培养基
放线菌#A34是Streptomyces sp.链霉菌属，由中山大学生命科学院从海南陵水猴岛海底沉积物中分离得到，孢子成密螺旋状，菌落正面海军蓝色，反面海涛蓝色，无色素。产抗细菌活性物
质。放线菌#A34由广东省农科院植保所发酵罐培养350L。培养基为：KNO3 1g； K2HPO4 0.5g；MgSO4 0.5g；FeSO4 0.01g；可溶性淀粉 20g；海盐 40g；蒸馏水 1L； pH 6.5。
真菌#1942由香港城市大学Vrijmoed和Jones教授于香港附近海域分离得到, 菌种分别保存在香港城市大学和中山大学内。真菌#1942由天然有机室摇床培养150L。采用GYT培养基：Glucose(葡萄糖) 1.0％；Yeast-Extract(酵母膏) 0.1％；Tryptone(蛋白胨) 0.2％；pH 7.5； ASW（人工海水）100ml。
3.3 培养与形态
放线菌#A34由发酵罐培养，通氧气发酵培养3天，得到白色菌体和浅色的发酵液。 真菌#1942菌种接入GYT琼脂斜面后，置于22℃恒温培养箱里培养7天，再接入装有100mlGYT培养基的500ml的三角瓶里室温培养15天。然后将已长好的#1942菌种转接入内装300mlGYT培养基的500ml三角瓶中，共约150L。5天后培养液里出现少量的菌丝体，10天后液面出现白色的菌体，溶液颜色变深，30天后液面长满菌体，菌体颜色由白变红，培养液颜色变红变暗。45天后溶液颜色不再变化为深暗红色，菌体为红黑色。
3.4 提取与分离
#A34的菌体和培养液用纱布分离。菌体风干后甲醇充分提取（250L×3），提取液合并浓缩得粗提物20g。培养液于60℃减压浓缩三次，用乙酸乙酯充分萃取得发酵液粗提物约10g；硅胶拌
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样过柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得化合物A34-1、2、3。
#1942的发酵总物用纱布过滤得菌体。菌体风干后用甲醇浸泡提取，蒸干得到浸膏约30g,再用乙酸乙酯提取得到菌体提取物。培养基用乙酸乙酯萃取得到培养基提取物。菌体、培养液的提取物分别拌硅胶过柱，以乙酸乙酯和石油醚混合溶液梯度淋洗。收集各组分再经反复柱层析，制备薄层层析，重结晶纯化，得化合物1942-1、2、3、4。其中20-30%洗脱出1942-1，50%-60%洗脱出1942-2。1942-1三次重结晶后为淡黄色长针状晶体，约800mg。
四 结果与讨论
4.1放线菌#A34
放线菌#A34自海南陵水猴岛海底沉积物中分离得到，由发酵罐培养350L。培养液提取物通过反复柱层析得到以下三个化合物：A34-1、2、3。经核磁共振、红外波谱等分析手段以及与文献[5-6]对照可确定结构如图Ⅰ，实验数据见附录。
OCH3H3CCH2CH2CH2CHCHCH3HOOCA34-2: piliformic 酸HOOCCOOHA34-1: 2-正丁基-3-甲基-丁二酸NHA34-3: 尿嘧啶O图ⅠA34-1、2、3结构式4.2真菌#1942
真菌#1942自香港附近海域分离得到，由天然有机室摇床培养150L。菌体提取物通过反复柱层析得到以下三个化合物：1942-1、2、3、4。其中1942-1经柱层析（20-30%乙酸乙酯和石油醚混合溶液反复洗脱）、重结晶等操作分离提纯，根据核磁、质谱等分析方法确定结构为柄杆菌素（Sterigmatocystin）。柄杆菌素是黄曲霉素的生源合成前体，具有很高的研究价值。 1.1942-1:7H-Furo[3',2':4,5]furo[2,3-c]xanthen-7-one,3a,12c–dihydro–8-hydroxy-6-methoxy-(9CI) (柄杆菌素,Sterigmatocystin)
C18H12O6, 淡黄色长针状晶体，m.p. 249～251℃，薄层层析石油醚∶乙酸乙酯3∶1，Rf=0.45。
1
H NMR(500MHz,CDCl3,TMS) 13.09(1H,s),7.48 (1H,t,8.1,8.4Hz),6.82 (1H,d,8.1Hz), 6.81(1H,d,7.1
Hz),6.74(1H,d,8.4Hz),6.50 (1H,m),6.42(1H,s), 5.44(1H,t, 2.7Hz), 4.80(1H,m), 3.99(3H,s)；13C NMR (CDCl3): 181.2, 164.6,163.4,162.4, 155.0, 154.1,145.4, 135.8,113.5, 111.4, 109.1,106.7,106.1,102.7, 90.7,57.1,48.4; FABMS 中分子离子峰m/e 325 [M + 1]+;元素分析(w/%,): C 66.23, H 4.174. 计算值(C18H12O6): C 66.67, H 3.70。
通过分析13C NMR可知分子中含有18个碳原子，其中1个OCH3、8个CH、9个季碳。δ
H 6.82
[7]
为缩醛基，羟基δH 13.09 处于低场，说明可能存在氢键C=O……H—O—。进一步与文献
H波谱数据及13C NMR 谱图对比得到确证，结构如图Ⅱ，谱图见附录。
OHHHOHHH图Ⅱ1942-1 柄杆菌素(Sterigmatocystin)OOMeHOOH
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sterigmatocystin最初从真菌Sterigmatocystis[8]中发现，后来又从曲霉菌Aspergil -lus nidulans, Aspergillus flavus, Aspergillus ustus and Aspergillus versicolor[9-11]中发现该化合物，并通过药理实验确定其有细胞毒性和致癌活性，引起了人们广泛关注。
sterigmatocystin 是细胞毒性更强的化合物黄曲霉素（aflatoxin B1）的生源合成前体，它本身的活性很弱，（Bel-7402 and NCIH-460 in vitro with IC50 96.53×10-6 and 72.52×10-6 g/mL resp [7]）但被体内的氧化酶活化之后，形成非常活泼的致癌前体——环氧化物，易受到遗传物质中鸟嘌呤极具亲核作用的7位N的进攻而形成sterigmatocystin –formamido pyrimidine（FAPY）加合物，并进行复制和繁殖 [12] ，机理见图Ⅲ。
HHHOHOHHOOHHNNCHONNHRdOHHOCH3Oduplex[ST]A1-A2-T3-F4-C5-A6-T7-T8OHH2NT8-T7-A6-C5-F4-T3-A2-A1[ST]
由于食品饲料中普遍存在产生sterigmatocystin的真菌，所以研究这类化合物的快速高效的
图Ⅲ sterigmatocystin 致癌机理检测方法和其致癌机理逐渐成为热点。如2004年Stroka, Joerg等人报道的采用高效氨基酸薄板层析方法，最低检出浓度为2μg/kg 。另一方面，sterigmatocystin价格非常昂贵，1996年Sigma -Aldrich公司报价为20.75美元/毫克，此后价格一路攀升，2002年为29.80美元/毫克，2003年为37.10美元/毫克，2005年最新报价为40.90美元/毫克。这给研究工作带来极大不便。而通过发酵培养海洋真菌#1942 150L得到约800mg的sterigmatocystin，为sterigmatocystin及其同类化合物的研究工作提供了廉价的来源。 2.其他化合物
1942-2、3、4经核磁共振等分析手段以及与文献[13-14]对照可确定结构如图Ⅳ，实验数据见附录。
OHOHOHOO1942-2类Bostrycin化合物OOCH3OHOHO1942-4麦角甾醇 1942-35-methylmellein 图Ⅳ 1942-2、3、4结构式
4.3结论及展望
对放线菌#A34和真菌#1942的代谢产物进行分离鉴定，得到7个化合物，其中包括价格昂贵，有细胞毒性的sterigmatocystin。其含量高达约1g/100L ,有可能开发成为资源菌。
海洋微生物能产生丰富的结构独特的生物活性物质，利用现代微生物发酵技术，把海洋微生物作为药物的生产者，有可持续发展，成本低廉，质量保证等优点。随着研究的不断深入，微生物将会创造出更大的经济和社会效益。
致谢：导师林永成教授从理论上和实践上对本文的工作做了深入细致的指导，在此向导师致以诚挚的谢意和崇高的敬意；感谢天然有机实验室的王立博士对本论文的指导与帮助。
同时对天然室的全体老师和师兄师姐的支持和帮助表示感谢。本实验得到中山大学化学与化工学院第五届创新化学实验与研究基金的资助和中山大学测试中心提供的帮助，特此鸣谢！
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参 考 文 献
[1]Masashi Tsuda, Masaaki Yamakawa, Seiko Oka et al. Brasilibactin A, a Cytotoxic Compound from Actinomycete Nocardia brasiliensis. J. Nat. Prod. 2005, 68, 462-464
[2]Scott S. Mitchell, Benjamin Nicholson, Sy Teisan, et al. Aureoverticillactam, a Novel 22-Atom Macrocyclic Lactam from the Marine Actinomycete Streptomyces aureoverticillatus. J. Nat. Prod. 2004, 67, 1400-1402
[3]Kevin D. Hyde, V. Venkateswara Sarma, E.B. Gareth Jones. Marine Mycology-A Practical Approach 2000. Leds. K.D.Hyde and S.B. Pointing Soc., Perkin Trans. 1, 1999,715-719.
[4]M Sugano, A Sato, Y Iijima, et al. Phomactin A: A Novel PAF Antagonist from a Marine Fungus Phoma sp. J Am Chem Soc,1991,113:5463~5464.
[5]Anderson, John R, Edwards et al.Metabolites of the higher fungi. Part 2. 2-Butyl-3-methylsuccinic acid and 2-hexylidene-3- methyl succinic acid from xylariaceous fungi. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1:Organic and Bio-Organic Chemistry ,1985 1481-1485.
[6]Wong J L, Fushs D S. Competitive Isomerization and Dealkylation of 2,4-Dialkoxypyrimidines in Aqueous and Nonaqueous Media. J. Org. Chem. 1970,35:3786.
[7]Cox R H, Cole R J. Carbon-13 nuclear magnetic studies of fungal metabolites, aflatoxins, and sterigmatocystins. J. Org. Chem. 1977, 42(1): 112-114.
[8]Nekam Lewis, Polgar P. The inihibitory effect of a mold upon staphylococcus. Urologic and Cutaneous Review. 1948, 52:372-5. [9]Davies J. E., Roberts John C., Wallwork S. C. Sterigmatocystin, a metabolic product of Aspergillus versicolor. Chemistry & Industry (London, United Kingdom). 1956, 178.
[10]Chen R. S.,Tsay. Polymerase chain reaction-mediated characterization of Molds belonging to the Aspergillus flavus group and detection of Aspergillus parasiticus in peanut kernels by a multiplex polymerase chain reaction Journal of Food Protection 2002 ,65 (5) :840-844.
[11]Brown D. W., Adams, T. H., Keller, N. P. Twenty-five coregulated transcripts define a sterigmatocystin gene cluster in Aspergillus nidulans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA .1996,93:1418-1422.
[12]Gopalakrishnan S, Patel D J. Formation and structural features of a sterigmatocystin-formamidopyrimidine adduct at the DNA duplex level. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115: 9321-9322.
[13]姜广策,林永成,周世宁等.中国南海红树内生真菌#1403次级代谢物的研究.中山大学学报(自然科学版),2000,39(6):69. [14] Anderson J R, Edwards R L, Whalley A J S. Metabolites of the higher fungi. Part 21. 3-methyl-3,4-dihydroisocoumarins and related compounds from the Ascomycete family Xylariaceae. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1:Organic and Bio-Organic Chemistry. 1983, 2185-2192.
附 录
1. A34-1: C9H16O4, 无色块状固体,molecular weight 188.22;1H NMR（300MHz ,CDCl3 ,TMS）:2.67（2H,m）,1.68（1H,ddt, 4.5,9.0, 9.0Hz）,1.52（1H,ddt,5.5,9.0,9.0Hz）,1.32（4H,m）,1.17（3H,d, 7.0 Hz）,0.90（3H,t,6.5Hz）;13C NMR (500MHz , CDCl3, TMS):180.4, 179.6,47.4,41.1, 29.6,29.5, 22.4,13.8, 13.7.
2.A34-2: C11H17O4,白色粉末, mp: 148-150℃,1H NMR :(500MHz, CDCl3, TMS):12.11 (2H, brs),7.02 (1H,t, 7.5Hz),3.57(1H,q,7.5Hz), 2.27-2.21(2H,m,7.5Hz), 1.50(2H,m,7.0Hz),1.32-1.31(4H,m), 1.35 (3H, d,7.5Hz),0.90(3H,t,7.5Hz);IRν/㎝-1 (KBr): 3840, 3754,2930, 1796,1716,1677, 1462,1301, 1252. 3. A34-3: C4H4N2O2,黄色针晶, mp＞260℃(升华); molecular weight:112;1H NMR (500MHz,DMSO): 5.42(1H,d,7.5Hz), 7.35(1H,d,7.5 Hz),10.72(1H,s),10.91 (1H ,s).
4.1942-2: C16H16O6,褐色结晶,molecular weight: 304.29, mp 213-215℃, 1H NMR(500MHz, CDCl3, TMS): 12.60(1H,s),7.62(2H,brs), 7.36(1H,s),6.11(1H,s),3.90(3H,s),3.82(1H,t, 5.5, 5.5Hz), 3.08(1H,d, 17Hz,H),2.99(1H,dd,18.5,5Hz),2.92(1H,dd,18.5,5.5Hz),2.79(1H,d,17 Hz,H),1.26(3H,s).
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5.1942-3: C11H12O3,针状晶体,mp 131-133℃;FABMS m/z: 193[M+1]+;1H NMR(500MHz,CDCl3): 11.07(1H, s), 7.38(1H,d,8.5Hz), 6.78 (1H,d,9.0Hz),4.75(1H,m),3.13(1H,dd,3.5, 17Hz), 2.72(1H,dd, 12, 17Hz), 2.21(3H,s), 1.51(3H,d,6.5Hz).
6.1942-4: C28H44O,白色针状结晶, mp 155-157℃; 1H NMR(CDCl3,TMS): 0.63(3H,s),0.83 (3H,d, 6.0 Hz),0.84(3H,d,6.0Hz),0.92(3H,s), 1.03(3H,d,6.5Hz),3.64(1H,m),5.19(1H,dd,15.5,8.0Hz),5.22(1H,dd, 15.0,7.0Hz),5.38(1H,d,6.0Hz),5.57(1H,d,4.0Hz).
图Ⅴ1942-1 Sterigmatocystin 1H NMR（500MHz,CDCl3,TMS）
The metabolites of marine actinomycete and
marine fungus #1942
Peng Hong Wang li,Lin Yongchen*
School of Chemistry and Chemical Engineering，Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China
Abstract The environments of oceans are highly complex. Marine microorganisms have develo-
ped unique heredity and physiological capabilities that offer the potential to produce compounds that would not be gain from terrestrial microorganisms. This thesis expounds the significances in the metabolites of marine actinomycetes and fungi and the advancements.
In the second part, the metabolites of marine actinomycete #A34 and marine fungus #1942 were studied. 7 compounds were isolated including sterigmatocystin from marine fungus #1942, which is expensive and toxic. The high content of sterigmatocystin in the fungus indicates that the fungus may be as a resource fungus of sterigmatocystin.
Key words metabolites, marine actinomycetes, marine fungi
你懂的：www.179gm.com
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希望你过的开心，快乐，谢谢。
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