大麦β葡聚糖的制备研究

安徽农业科学，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｈｕｉ　Ａｇｒｉ．　Ｓｅｉ　．２００５　，　３３　（５）　：８６７一８６８责任编辑孙红忠责任校对孙红忠大麦ｐ一葡聚糖的制备研究闲劲松，，刘敏“，吴克，，张洁‘，李龚，（１合肥学院生物与环境工程系，安徽合肥２３００２２；２中国科学院离子束生物工程重点实验室安徽合肥２３００３１）摘要采用酶解的方法对大麦中卜葡聚糖进行分离制备，件葡聚糖的提取率为２　％　ｏ　ＤＮＳ法和考马斯亮蓝法检测提取品无还原糖和蛋白质。与标准的件葡聚糖进行比较，可作为底物对件葡聚糖酶活性测定。关键词大麦；Ｐ－葡聚糖；分离纯化；Ｐ－葡聚糖酶活力中图分类号Ｓ５１２．３文献标识码Ａ文章编号０５１７一６６１１（２００５）０５一０８６７一０２Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ卜Ｇｌｕｃａｎ　ｆｒｏｍ　ＢａｒｌｅｙＫＡＮ　Ｊｉｎ－ｓｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ　　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＆Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｈｅｆｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｈｅｆｅｉ，Ａｎｈｕｉ　２３００２２）Ａｂｓｔｒａｃｔ　　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅｒｐａａｒｔｉｏｎ　ｏｆ俘目ｕｃａｎ　ｆｏｒｍ　ｂａｒｌｅｙ　ｗａｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ场ｅｎｚｙｍｅ　ｔｅｒａｔｍｅｎｔ．＇Ｉｈｅ　ｅｒｃｏｖｅｙｒｏ　ｆ各目ｕｅａｎｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｒｅａｃｈｅｄ　２％．Ｎｅｉｔｈｅｒ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｓｕｇａｒ　ｎｏｒ　ｐｏｒｔｅｉｎ。ｄｅｔｅｒｎｖｎｅｄ坊ＤＮＳ　ａｎｄ　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　Ｔｈｅｅｒｗ　ａｓ　ｎｏ　ｄｉｆｅｅｒｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ仔ｇｌｕｃａｎ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ａｎｄＳｉｇｍａ＇ｓ　ａｓ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｙｔ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　　Ｂａｒｌｅｙ；　（３－ｇｌｕｃａｎ，　Ｓｅｐａａｒｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ；　（３－ｇｌｕｃａｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｙｔｄ　ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ－Ｐ　　　　葡聚糖是谷物胚乳和糊粉层细胞壁的一种非淀粉多１．２．３去淀粉。将渣按１：６溶于水，９０℃加耐高温ａ－淀粉酶糖，主要存在于大麦和燕麦的糊粉层和胚乳细胞壁中川。由１．５　ｍ１，３０　ｍｉｎ处理将淀粉糊化（用碘液检查是否有淀粉），降于Ｒ－葡聚糖的存在具有较高的粘稠性，又无法被单胃动物消至６０℃，加高效糖化酶（州值４．０一４．５）处理２　ｈｏ化利用，导致动物对其他营养物质的消化率降低，成为麦类１．２．４去蛋白。冷却至３２　０Ｃ，加胰蛋白酶，州值８．０处理饲料中的抗营养因子，降低了鸡、猪等对大麦饲料的利用率。上述溶液２　ｈ（１０００　ｍｌ去淀粉液加蛋白酶０．５　ｍｌ）．各葡聚糖酶能降解各葡聚糖分子中的件１，３和各１，４糖营键，１．２．５灭酶活。９０℃保温１０　ｍｉｎ，灭酶。有利于动物对营养物质的消化和吸收，提高生长性能和粮食１．２．６去杂。８　０００　ｒ／ｍｉｎ离心，取上清，上清液含卜葡聚糖、的转化率。随着大麦饲料的推广，作为去除抗营养因子的各氨基酸或寡肤、单糖和低聚糖。葡聚糖酶的使用也越来越多。测定件葡聚糖酶活力使用的１．２．７超滤、浓缩，去小分子物质。将上清液用截留分子量底物件葡聚糖，过去主要依靠进口，售价昂贵。因此笔者就为１００００的膜Ｉ月一葡聚糖分子量为（１一２０）／１（１ｅ］，　压力０．２１Ｒ－葡聚糖的制备进行研究。ＮＩＰａ，　３０℃浓缩４倍。浓缩液加等体积无水乙醇，洗涤，８０００１材料与方法ｒ／ｍｉｎ离心，弃上清。沉淀加少量无水乙醇洗涤，离心，弃上１．１材料清。再重洗１次，８　０００　ｒ／ｍｉｎ取沉淀，干燥。１．１．１原料和试剂：大麦，安徽阜阳市场购买；标准各葡聚１．２．８蛋白质浓度的测定［４］。采用考马斯亮蓝法，取０．５　ｍｌ糖，美国Ｓｉｇｍａ公司产品。一定稀释度的粗酶液，加５　ｍｌ考马斯亮蓝Ｇ２５０蛋白质试１．１．２仪器。７２１分光光度计（上海精密科学仪器有限公剂，将溶液摇匀，２　ｍｉｎ后用７２１分光光度计，测５９５　ｒｕｎ处ＯＤ司）；ＳＣＭ杯式超滤器（中科院上海应用物理所膜分离技术研值，根据蛋白质标准曲线得蛋白质浓度。究发展中心）ＴＡＬ－５离心机（上海安亭科学仪器厂）；ＳＨＡ一水１．２．９还原糖测定［５］。取适当稀释酶液１．１　ｍｌ，直接加人３浴恒温振荡器（江苏金坛金城国胜仪器厂）。ｍｌ　ＤＮＳ，煮沸１０　ｍｉｎ，用ＤＮＳ法测定。１．１．３主要生化试剂。３，５二硝基水杨酸（ＤＮＳ），考马斯亮１．２．１０　Ｐ（－葡聚糖酶活力的测定［６１０　０．１　ｍｌ一定稀释度的酶蓝Ｇ２５０，均为ＡＲ；耐高温ａ一淀粉酶和高效糖化酶系无锡杰液加到已预热的１　ｍｌ　１　％昆葡聚糖悬液中，５０℃振荡反应１０能科生物工程有限公司产品；胰蛋白酶为上海化学试剂公司ｍｉｎ，加３　ｍｌ　ＤＮＳ终止反应。水浴煮沸１０　ｍｉｎ；冷却后加１６．４产品。ｍｌ水充分混匀，用７２１分光光度计测５５０　ｒｉｍ吸光度（ＯＤ值）。１．１．４仔葡聚糖酶粗酶液的制备。三角瓶中液态发酵培养以件葡聚糖为标准，１　ｍｉｎ生成１　ｉｊｇ还原糖定义为１个酶活力基５０　ｍｌ培养后，３　５００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ，取上清得粗酶液。单位。１．２方法参考有关文献Ｌ‘一’〕并加以改进。２结果与分析灭内源酶活。大麦４０目磨成粉，８５　０Ｃ烘１ｈ灭内源２．１回流时间的影响根据固液萃．取原理，增加提取时间可提高得率。图１显示，回流过程中，随着时间的增加，脂肪去脂。大麦粉（２５０妇按重量与体积比１：４加人无水渐被去除，２５　ｍｉｎ后，得率几乎不再变化，说明脂肪已除尽。乙醇；回流２０　ｍｉｎ，趁热离心（３　５００　ｒ／ｍｉｎ）１０　ｍｉｎ，取渣。回流用的乙醇浓度也影响得率，浓度越高除脂相对越多越基金项目安徽省教育厅自然科学基金（２００ｋｊ２８６），合肥学院科研基金快。考虑到费用、人力和其他因素，回流时间选择２５　ｍｉｎ，回资助。流用乙醇浓度为９５％．作者简介阔劲松（（１９６４一），男，安徽肥东人，硕士，副教授，从事分子生２．２淀粉去除热水浸提过程中，淀粉发生糊化，和多糖混物学方面的研究。鸣谢感谢潘仁瑞教授的悉心指导。在一起，通过加人淀粉酶作用去除。淀粉的去除效果以碘液收稿日期２００５－０４－２０与提取液的反应颜色来表示。颜色越浅说明去除效果越好。８６８安徽农业科学２００５年Ｊ任一次超滤还原糖去除率可达６　　　　７％。可以二次加蒸馏水件Ｊ％或多次超滤以去除单糖、硫酸馁等小分子物质。用饱和硫酸１１斗凡，‘铰将多糖沉淀，然后用无水乙醇洗涤，再离心收集。冻干后炸Ｊｌｌ可得到２％的Ｒ－葡聚糖。与文献报道Ｒ－葡聚糖含量为４％－１０％，提取率为３．２％左右稍有不同［‘〕。可能是由于与水不ＣＵ１０　　　　　　１５　　　　　　２０溶性的Ｒ－葡聚糖未提出和提取中的损失有关，特别是纯化过时间Ｉ　　　　Ｉ　ｍｉｎ程中损失的Ｒ－葡聚糖。图１回流时间对得率的影响２．４自制糖与标准糖的比较由表３可以看出，自制的各葡聚糖与标准的Ｒ－葡聚糖差距不大，重复性好。利用自制糖测表１淀粉酶水解淀粉效果定的酶活力比进口的测定值平均低１８％，自制糖可代替进口加酶量时间／　　　　　　　　　　／／　ｍｉｎ的标准糖来进行件葡聚糖酶的活力测定，但需要乘以一定的ｍｌ　　　　　　３０印９０　　　　　　１２０　　　　　　１５０　　　　　　　　１８０系数加以校正。５＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ｒｏ表３　　　　自制底物与标准糖的比较巧为底物来源样品酶活／／／Ｕ／ｇ注：反应底物为１００９大麦粉。＋十十：碘液检验呈深蓝色；＋＋：呈２３平均相对值蓝色；＋：呈弱蓝色；一：颜色基本无变化。标准糖２８３．１４　　　３００．０７　　　２９１．６２２９１．６１考虑到成本和时间及后处理等一系列分离纯化问题，　　　　选择１００　ｇ大麦粉糊化后加人１５　ｍｌ糖化酶，反应２　ｈｏ参考文献２．３超滤和纯化通过超滤可有效地去除一些单糖及其他１李孝辉，何海玲，钱玉英．大麦中提取件葡聚搪的研究【１ｌ．粮食与饲料工业，　　１９９８，（４）：４２．小分子物质，在超滤前后测还原糖的ＯＤ值（表２），通过还原２管晓，姚惠源．燕麦鼓中各葡聚糖提取工艺的研究仁Ｊｌ．食品科技，２００２，糖标准曲线图可以知道超滤去除还原糖的情况。（１　　　　０）：６３一苗．表２　　　　超滤前后还原糖含量比较３赵丹，齐颖．青棵Ｐ－葡聚糖提取工艺研究［ｊ］．粮食与油脂，２００４，（１０）：２６一２８．　　　　ＯＤ值浓度／／／ｍｇ／ｍｌ４　　Ｍｃｌｍｉｇｈｔ　Ｇ　Ｓ．　Ａ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｈｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｏｔｅｒｒｒｕｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｂｍｉｃｉｎｇｒａｍ超滤前　　０．１４７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．２９ｑｕ　　ａｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｔｏｅｉｎ［Ｊ］　．　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９７７，７８．８６一８８．超滤后　　０．１６２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６８５　　Ｍｉｌｅｒ　Ｇ　Ｌ．　Ｕｓｅ　ｏｆ　ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅａｇｅｎｔ俪ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｃｆ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｓｕｇａｒ［　　Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｃｈｅｍ，１９５９，３１（３）：４２６一４２８．６汪做．饲用复合酶制剂中件葡聚搪酶活测定方法的研究［Ｊ〕饲料研究，２０　　　　００，（５）：５一７．（上接第８５６页）高了肉鸡的生长速度，因此在肉鸡生产中具有很高的利用比降低的趋势（表２），至２一６周，添加１００　ｇ／ｔ壳聚糖组鸡分价值，值得进一步推广应用。其用量以２００岁ｔ左右为宜。别比对照组降低２．２７％一３．４０％　（ｐ　＞　０．０５），（３）组鸡的料参考文献重比分别比对照组降低４．７６％一７．７３％　（ｐ　＜　０．０５），其中５１将廷大甲壳素仁Ｍｌ．北京：化学工业出版社，２００３．１－６．一６周龄差异极显著（ｐ＜０．０１）；此时添加２００岁ｔ壳聚糖组２吕中明，石根勇，Ｍ霞，等．壳聚糖免疫调＂｝作用的研究【Ｊｌ．实用预防医学，　　２００１，８（５）：３３２一３３５．鸡比添加１００　ｇ／ｔ壳聚糖组鸡的料重比也显著降低（ｐ　＜３张为胜，刘丽海，李诗标，等．壳聚糖在畜牧业中的应用【Ｊｌ．山东畜牧兽０．０５）。由此说明，壳聚糖可以降低肉鸡的料重比，提高饲医，　　　　２００２，（７）：４７一４８．４宁维颖．甲壳素与壳聚糖在家禽饲料中的应用【Ｊｌ．山东家禽，２００３，（６）：料转化率。４８一５０．　　　　３讨论５　　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｄ　Ｐ．　Ａｄｊｕｔａｎｔｓ　ａｎｄ　ｋ　ｒｎ　ｕｉｏｓｔｉｎａｉｌａｎｔｓ　ｆｏｒ　ｅｎｈａｎｃｉｎｇ。ｐｏｔｅｎｃｙ　ｉｎ　　　　壳聚糖是一种天然无毒的直链多糖，具有生物相容性，ｉｆ　　ｓｈ［Ｊ］．ｌｋｏ　Ｂｉｏｌ　＆ａｎｄ，１９９７，（９０）：２５７一２６５．６　　Ｍａｙｓｉｎｇｅｒ　Ｄ，　Ｂｅｅｒｚｏｖｓｋａｙａ　０，　Ｆｅｄｏｒ　ｆＳ　．　Ｔｈｅ　ｈｅ　ｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｃｙｔｏｌｄｎｅ　ｃｏｌｏｎｙ能被生物降解。虽然肉鸡体内不存在壳聚糖酶系，但却存ｓ　　ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　１　ｉｓ　ａｌｓｏ　ａ　ｇｏｒｗｔｈ　ｆａｔｃｒｏｉ　ｎ　ｔｏ　ＣＮＳＭ　：　ｒｎｉｍｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ　ＣＳＦ－在溶菌酶、蛋白酶和脂肪酶等，这些酶在体外对分子状态的１　　　ａｎｄ　ＬＭ－１０　ｃｅｌｓ　ａｓ　ｄｅｉｌｖｅｒ　ｓｙｓｔｅｍｓ　［Ｊ］　．　Ｅ＊ｒｉｒｒａｎｕａｌ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ＇，　１９９６，１４１（１）４７一５６　　　　壳聚糖都具有不同程度的水解作用。通常认为壳聚糖在胃７　　Ｒｈｏａｄｅｓ　Ｊ，　Ｒｏｌｅｒ　Ｓ．　Ａｎｔ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｄｅｇｒａｄｅｄ　ａｎｄ　ｎａｔｉｖｅ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ａｇａｉｎｓｔ里是不能被消化吸收的。但有报道提出，在鸡饲料中添加２　　　　ｓ　　０００，ｐｏｉｌａ６６（１）：ｇｅ　ｏｒｇａｎ８０一８６．ｉｓｍｓ　ｉｎ　ｌａｂｏｒａｔｒｏｙ　ｍｅｄｉａ　ａｎｄ　ｆｏｏｄｓ［　Ｊ　］　．　ＡＰＰＬ　Ｅｍ　ｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，壳聚糖，可使鸡肠道中的双歧杆菌增殖，阻止有害菌生长，８储益平，殷书梅．壳聚糖对免疫系统作用实验研究「Ｊ」时珍国医国药，产生大量消化乳糖所需的乳糖酶，这对消化乳糖有困难的１　　　　９９９，１０（１）：１４一１６．９朱立贤，宋志刚，林海，等．壳聚糖对肉鸡生产Ｉｔ能和血清胆固醇含量的家禽来讲是非常有意义的［１９１。此次试验表明，壳聚糖对肉　　影响［Ｊ〕中国饲料，２００２（１７）：１９一２Ｄ．鸡的生长和饲料转化率均具有很强的促进作用，在日粮中１０马刁毋，杨烨，谢新东，等．壳聚糖对肉仔鸡（公鸡）生长性能和脂肪代谢的影响［　　　　Ｊｌ．福建农业大学学报，２００３，１６（４）：３２一３５．添加２００岁ｔ的壳聚糖对肉鸡体均重和料重比都有显著影１１朱立贤，宋９：ｌｆｘ　１，林海，等．壳聚糖对肉鸡生长与免疫功能的影响研究响，这与有关报道〔‘。一’２］基本一致。壳聚糖作为一种绿色饲［　　　　Ｊｌ．中国饲料，２００３（４）：１６一１７．１２何德肆．仔鸡日糖中配加壳聚糖效果试验报告［Ｊｌ．畜禽业，１９９９，１１５料添加剂，添加在肉鸡的日粮中，既解决了药残问题，又提（　　　　１１）：２８．