不同血清浓度对大鼠软骨细胞增殖、形态和基因表达的影响

刘丽芳;薛艳;郑昱新;曹月龙;丁道芳

【摘 要】目的 观察不同血清浓度对大鼠软骨细胞体外培养的形态、增殖和基因表达的调控作用.方法 取出生24h SD大鼠关节处软骨,0.1％浓度的Ⅱ型胶原酶多次消化后获得软骨细胞.软骨细胞培养于含5％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),10％ FBS和20％ FBS的DMEM低糖培养基中,分别为5FBS组,10FBS组和20FBS组.24h后镜下观察细胞形态变化,CCK8方法检测24、48和72h软骨细胞增殖.Western blot法检测软骨指标Ⅱ型胶原A1(COL2A1)和MMP13(matrix metalloproteinases13)表达,定量PCR检测软骨特异性基因Sox9、A-can、ADAMTS5、MMP9和MMP3的表达及代谢相关基因Nme2和PnP表达.结果 5FBS组的软骨细胞呈由鹅卵石样排列,10FBS组和20FBS组细胞呈现长梭形改变,且血清浓度越大,形态改变越明显.和5FBS组比较,10FBS组和20FBS组细胞增殖明显,呈血清浓度依赖性增加.10FBS组和20FBS组的MMP13表达显著上调,Ⅱ型胶原表达显著下调.PCR结果表明,和5FSB组比较,10FBS组和20FBS组的A-can和Sox9表达下降,MMP9、MMP3和ADAMTS5表达上调,且基因表达变化和血清浓度改变呈正相关.同时随着血清浓度增加,Nme2和PnP表达显著上调.结论 血清浓度的增高促进软骨细胞代谢,引起软骨细胞退变. 【期刊名称】《医学研究杂志》 【年(卷),期】2018(047)009 【总页数】6页(P53-57,33)

【关键词】血清浓度;软骨细胞;细胞增殖;形态改变;营养状态

【作 者】刘丽芳;薛艳;郑昱新;曹月龙;丁道芳

【作者单位】200240 上海交通大学;201203 上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心;201203 上海市中医药研究院骨伤科研究所;201203 上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心;201203 上海市中医药研究院骨伤科研究所;201203 上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心;201203 上海市中医药研究院骨伤科研究所;201203 上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心;201203 上海市中医药研究院骨伤科研究所 【正文语种】中 文 【中图分类】R332

关节炎在我国的总发生率约为13%，其中以骨关节炎(osteoarthritis，OA)为最常见，发生随年龄增加而上升。骨关节炎是一种多因素引起的关节退行性改变的疾病。目前该疾病影响着数百万人，其治疗仍然是一个未解决的问题。其病理特点包括关节软骨变性破坏、软骨下骨硬化或囊性变、关节边缘骨质增生、滑膜增生、关节囊挛缩、韧带松弛或挛缩、肌肉萎缩无力等。据最新数据统计，在60岁以上的人群中，X 线检查有表现的骨关节炎女性发生率约42.8%，男性约21.5%，有症状的骨关节炎的女性发生率约为15%，男性约5.6%。且中国骨关节炎的现患率高于欧美国家[1～4]。

目前主要分为3类：衰老相关的骨关节炎，损伤导致的骨关节炎和代谢综合征相关的骨关节炎。其中代谢综合征引起的骨关节炎最常见。代谢异常造成高营养状态如肥胖，既往的研究认为肥胖产生的过度的机械负荷超出关节承载能力，这是导致软骨损伤及骨关节炎的发生的主要原因, 近年来肥胖的人群在整个世界范围迅速增

加，由肥胖引起的OA严重威胁发展中国家的人群的健康[5～7]。

为模拟软骨细胞在体外的营养状态，本课题设计了用3种不同浓度的血清来培养软骨细胞。分组培养大鼠软骨细胞后，观察软骨细胞形态增殖及软骨细胞退变的相关基因，代谢基因的改变。 材料与方法

1.动物:新生SD大鼠8只购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物合格证号:SCXK(沪2013-0016)。

2.药物与试剂:DMEM 低糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、双抗、磷酸盐缓冲液片剂均购自于Biowest公司；Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司)； GAPDH(美国CST公司)、COL2A1(美国Santacruz公司),MMP13(美国Santacruz公司)；RIPA裂解液(中国碧云天公司)、PMSF(中国碧云天公司)、BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司产品)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；AMV反转录酶(日本TaKaRa公司)；PCR试剂SYBR® Premix Ex TaqTM(日本TaKaRa公司)；CCK8(日本 Dojindo公司)，羊抗鼠和羊抗兔的二抗(美国CST公司)。

3.软骨细胞培养和形态学观察:采用本研究所已经成熟的软骨细胞培养方法，将8只新生24h SD大鼠75%乙醇浸泡5min麻醉处死，取出四肢关节处软骨，0.1%的Ⅱ型胶原酶消化1h，重复3～4次，收集消化的细胞悬液，1000r/min,离心10min取细胞沉淀，培养于含5%FBS(5FBS组)、10%FBS(10FBS组)和20%FBS(20FBS组)的低糖DMEM培养基中。为保证实验结果的可靠，本文中所有实验的血清均来自同一批次。

4.CCK8法检测细胞增殖情况：将细胞用胰酶消化后，以5×103个/孔接种于96孔培养板。分别培养于含5%FBS(5FBS组)、10%FBS(10FBS组)和

20%FBS(20FBS组)的低糖DMEM培养基中，培养24、48及72h后，每孔加入CCK8试剂10μl，培养箱中0.5h后，室温轻微振荡混匀，酶标仪450nm波长下

测定各孔A值。

5.Western blot法检测蛋白表达:采用Western blot法检测各组蛋白的表达情况。首先收集蛋白样品，原代细胞培养于含24h后裂解细胞和蛋白浓度测定，蛋白变性后备用。蛋白样品电泳和转膜，10%BSA室温封闭1h；一抗1∶1000稀释于封闭液中，4℃孵育过夜，TBST洗膜4次，每次10min；二抗室温孵育1h，二抗用TBST 1∶20000稀释，TBST洗膜4次，每次10min；化学发光法检测，X线胶片曝光显影。

6.Real-time PCR检测基因表达:原代软骨细胞经不同浓度(5%FBS、10%FBS和20%FBS)的胎牛血清培养24h，抽提总RNA及浓度测定，取2μg RNA反转录。按照说明书进行Real-time PCR检测，以GAPDH作为内参基因(表1)。 表1 基因引物序列引物名称引物序列(5'→3')A-can上游引物:GCAGGGATAACGGACTGAAG下游引

物:GAGTAAAGTGGTCATAGTTCAGCTTGMMP3上游引物:TCGGTGGCTTCAGTACCTTT下游引

物:CTGGAGAATGTGAGTGGGGTADAMTS5上游引

物:AGCCATCCTGTTCACCAGAG下游引物:CATTCCCAGGGTGTCACATMMP9上游引物:GGTCAGGTTTAGAGCCACGA下游引

物:GGTCAGGTTTAGAGCCACGASox9上游引物:ATCTTCAAGGCGCTGCAA下游引物:CGGTGGACCCTGAGATTGNme2上游引

物:CAAGCGATTCGAGCAGAAG下游引物:TGCTTCAGGTGTTCCTCAGAPnP上游引物:TAGGAGGGCTGACCGCTAA下游引

物:GCCATTCAGGAATCCAAACAGAPDH上游引物:TTCAACGGCACAGTCAAGG下游引物:CTCAGCACCAGCATCACC

7.统计学方法:采用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差

表示，组间差异采用单因素方差分析中LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 结 果

1.软骨细胞形态观察:大鼠软骨在含不同浓度FBS的低糖DMEM培养基中培养24h后，5FBS组软骨细胞大多数呈多角形等形态，排列成铺路石状；10FBS组和20FBS组软骨细胞部分向成纤维样细胞转变，且细胞形态逐渐细长，呈成纤维细胞样改变，20FBS组的软骨细胞成纤维样改变比10FBS组更为明显(图1)。

图1 倒置显微镜下各组细胞形态观察(×100)A.5FBS;B.10FBS;C.20FBS 2.软骨细胞增殖检测:软骨细胞传代后，分别培养于含5%FBS(5FBS组)、10%FBS(10FBS组)和20%FBS(20FBS组)的低糖DMEM培养基中。CCK8法分别连续观察3组细胞在24、48和72h增殖情况(图2)。3个不同时间点，测得20FBS组、10FBS组吸光度值与5FBS组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，且20FBS组与10FBS组均高于5FBS组。在48和72h两个时间点，20FBS组的吸光度值明显高于10FBS组(P<0.05)。

3.COL2A1和MMP13蛋白表达：软骨细胞培养于含5%FBS、10%FBS和20%FBS的低糖DMEM培养基中24h。提取总蛋白，检测COL2A1和MMP13的表达，随着血清浓度增加，MMP13表达也增加，两者呈正相关(图3A和B)；COL2A1表达和血清浓度的改变呈负相关。COL2A1的表达量下降,见图3C。

图2 3个时间点不同浓度血清中软骨细胞增殖的比较与5FBS组比较，*P<0.05；与10FBS组比较，#P<0.05

经过软件灰度值分析，MMP13和COL2A1各组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)，分别见图3B和图3D。

图3 不同浓度血清中软骨细胞的COL2A1和MMP13蛋白表达量的影响与5FBS组比较，*P<0.05；与10FBS组比较，#P<0.05

4.基因mRNA水平检测：软骨细胞传代24h后，分别培养于含5%FBS(5FBS组)、10%FBS(10FBS组)和20%FBS(20FBS组)的低糖DMEM培养基中24h。提取总RNA,定量PCR检测ADAMTS5、MMP3、MMP9、A-can、Sox9、PnP及Nme2的mRNA表达。ADAMTS5、MMP3、MMP9、PnP和Nme2的表达随着血清浓度的增加而显著增加，A-can和Sox9基因表达随血清浓度增加而下降，各组之间比较差异均有统计学意义(P<0.05，图4)。基质蛋白酶(ADAMTS5、MMP3、MMP9)和代谢相关基因的表达和血清浓度的改变呈正相关，A-can和Sox9表达和血清浓度改变呈负相关。

图4 不同浓度血清中软骨细胞相关基因的mRNA表达比较与5FBS组比较，*P<0.05；与10FBS组比较，#P<0.05 讨 论

最近的研究提出OA是由代谢异常引起的系统性炎性疾病，高营养状态(常见于肥胖患者)将容易造成代谢性炎症的发生。本次研究采用3种不同浓度的血清培养软骨细胞，模拟软骨细胞在体外的不同营养状态，观察软骨细胞形态，增殖及软骨细胞退变和代谢相关基因的改变[8～10]。

软骨细胞形态的改变及代谢增加都是早期骨关节炎重要的生理指标之一。本次研究通过收集P1代软骨细胞，在其培养皿中加入不同血清浓度的DMEM培养基使软骨细胞处于不同的营养状态中，建立软骨高营养模型。不同血清浓度培养24h后，形态学上有明显的改变，即软骨细胞在越高的营养状态下越难以维持自身原本多角形的正常形态，呈纤维细胞样形态，且生长速度加快，增殖行为越为明显，且形态

的改变和增殖均具有浓度依赖性。这一结果表明高营养状态会刺激软骨细胞形态改变及增殖加快，加速软骨细胞的代谢[11,12]。

正常的软骨结构是由细胞外基质如Ⅱ型胶原和可聚蛋白聚糖(aggrecan为主)组成。为维持软骨结构完整，基质成分通过基质降解酶如MMP13和ADAMTS5等不断进行更新和重塑，基质的降解和合成基质同时进行，从而维持软骨结构的完整。当软骨组织中这种合成和降解失衡时，软骨细胞将发生老化、退变和炎症。血清浓度对软骨细胞的影响不仅存在于细胞形态和增殖，同时基因表达也存在显著差异[13,14]。

COL2A1的缺失或者变异，通常能造成非常严重的软骨退化甚至衍生出骨骼异常的疾病。MMP13是降解软骨基质COL2A1主要的蛋白酶。通过蛋白定量分析COL2A1和MMP13的表达，发现大鼠软骨细胞COL2A1基因的表达随血清浓度的增高而呈现逐渐下调趋势，而MMP13的表达则呈逐渐上调趋势。可见高营养状态可能通过提高MMP13的表达来促进软骨细胞的退变[15,16]。

软骨细胞的退变还常伴随着其他基质降解酶的表达增加如ADAMTS5和MMP3，同时蛋白多聚糖的降解(A-can)。Sox9是软骨细胞中重要的转录因子，对软骨细胞表型的维持及正向调控Ⅱ型胶原基因的表达发挥重要作用。在笔者的研究中发现，高营养状态下，软骨细胞的标志基因A-can和Sox9都呈现逐渐下调趋势，而降解软骨基质的调控基因ADAMTS5、MMP9和MMP3都呈逐渐上调趋势[17～20]。

进一步研究代谢途径中重要的标志基因Nme2和PNP在不同的营养状态下的表达量差异，发现随着血清浓度的增高，大鼠软骨细胞的代谢基因表达均逐步上升。这些基因的改变与形态及增殖变化相一致，再次证明了高营养状态会破坏软骨细胞，表明了不同的营养状态对软骨细胞代谢水平具有重大影响，可能在早期骨关节炎病程中起着重要作用。

综上所述，本项研究在体外建立软骨细胞不同的营养状态的模型,观察了细胞增殖、形态、软骨细胞基质及调控基因,及代谢等基因的表达,验证了营养过剩的状态下易诱发软骨退变，而软骨退变是骨关节炎的发生的前期阶段，表明高营养状态与骨关节炎的发生存在相关性，从而警示公众营养过剩问题对于骨关节病程的危害性，也为骨关节炎的预防和治疗，提供了新的思路和方向[21，22]。关于血清中何种成分或者哪些成分对软骨细胞的增殖,形态和基因表达产生变化，目前还没有相关的报道，这也是我们接下来的研究所面临和解决的问题，这些成分很可能成为骨关节炎治疗的突破点。 参考文献

【相关文献】

1 Zhang Y, Xu L, Nevitt MC, et al. Comparison of the prevalence of knee osteoarthritis between the elderly Chinese population in Beijing and whites in the United States: The Beijing Osteoarthritis Study[J]. Arthritis Rheum， 2001， 44(9):2065-2071 2 NeflaM, Holzinger D, BerenbaumF, et al.The danger from within: alarmins in arthritis[J].Nat Rev Rheumatol,2016,12(11):669-683

3 丁呈彪,周云.膝骨性关节炎患者滑膜炎的发病机制及研究进展[J].中国组织工程研究,2015,19(51):8327-8332

4 吕庆列,勾禹,田发明,等.蛋白酶激活受体2在骨关节炎发病机制中的研究进展[J/OL].中国修复重建外科杂志,2017,31(12):1-7

5 Gierman LM, van der Ham F, Koudijs A, et al. Metabolic stress-induced inflammation plays a major role in the development of osteoarthritis in mice[J]. Arthr Rheum, 2012, 64(4):1172-1181

6 Thijssen E, van Caam A, van der Kraan PM. Obesity and osteoarthritis, more than just wear and tear: pivotal roles for inflamed adipose tissue and dyslipidaemia in obesity-induced osteoarthritis[J]. Rheumatology (Oxford), 2015, 54(4):588-600 7 李盛华,周明旺,陈娴,等. 代谢性骨性关节炎分子机制研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志,2016,22(2):233-237

8 Zhuo Q, Yang W, Chen J, et al. Metabolic syndrome meets osteoarthritis[J]. Nat Rev

Rheumatol, 2012, 8(12):729-737

9 Wang X, Hunter D, Xu J, Ding C,et al. Metabolic triggered inflammation in osteoarthritis[J]. Osteoarthr Cartil, 2015, 23(1):22-30

10 黄淑婷. 膝骨关节炎患者关节结构改变与脂肪细胞因子及肥胖的相关性研究[D].合肥：安徽医科大学,2014

11 Collins KH, Reimer RA, Seerattan RA, et al. Using diet-induced obesity to understand a metabolic subtype of osteoarthritis in rats[J]. Osteoarthr Cartil, 2015, 23(6):957-965 12 张磊,曾炎,扶世杰,等. C518大鼠膝关节正常和退变软骨细胞形态特征观察[J]. 中华临床医师杂志:电子版,2015,9(24):4606-4610

13 钱晓伟,潘丹岷,谭湘陵,等. 中药血清对大鼠bMSCs体外成软骨分化中COL2A1和Acan表达的影响[J]. 时珍国医国药,2012,23(2):340-343

14 季卫锋,童培建,袁小凤,等. 补肾法与活血法对SD大鼠膝骨性关节炎滑膜IL-1β、TNF-α及软骨MMP-13、ADAMTS-5的影响[J]. 中国中医骨伤科杂志,2012,20(2):1-5

15 Kobayashi M, Squires GR, Mousa A, et al. Role of interleukin-1 and tumor necrosis factor alpha in matrix degradation of human osteoarthritic cartilage[J]. Arthr Rheum, 2005， 52(1):128-135

16 刘宁, 谭文成, 夏吉生, 等. miR-34a靶向MMP-13调控大鼠软骨细胞凋亡的机制[J]. 暨南大学学报:自然科学与医学版, 2016, 37(2):139-145

17 Sandy JD, Verscharen C. Analysis of aggrecan in human knee cartilage and synovial fluid indicates that aggrecanase (ADAMTS) activity is responsible for the catabolic turnover and loss of whole aggrecan whereas other protease activity is required for C-terminal processing in vivo [J]. Biochem J, 2001, 358(Pt 3):615

18 Bau B, Gebhard PM, Haag J, et al. Relative messenger RNA expression profiling of collagenases and aggrecanases in human articular chondrocytes in vivo and in vitro [J]. Arth Rheum, 2010, 46(10):2648-2657

19 Tew S R, Li Y, Pothacharoen P, et al. Retroviral transduction with SOX9 enhances re-expression of the chondrocyte phenotype in passaged osteoarthritic human articular chondrocytes[J]. Osteoarthr Cartil, 2005, 13(1):80-89

20 黄林剑,李辉,谢千阳,等. 静压力下兔髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化[J]. 中国口腔颌面外科杂志,2014,12(4):295-300

21 马玉环,郑文伟,林平冬,等.骨关节炎软骨退变与炎症的关系[J].风湿病与关节炎,2015,4(8):50-53 22 郑晓芬.骨关节炎发病机制和治疗的最新进展[J].中国组织工程研究,2017,21(20):3255-3262