大肠杆菌培养操作规程

一、 目的及适用范围

制订本规程的目的为规范大肠杆菌总RNA的制备，保证为诊断试剂产品提供质量可控的质控品及标准品基质。本规程适用于南京实验室提取大肠杆菌总RNA的操作。依照本操作规程，每次可提前大约提取基质液原液。

二、 常规时间安排 预计安排 步骤 耗材准备 PBS储存液配置 第一天 培养基配制 灭菌 领取菌种 菌种复苏 第二天 接种 分装培养 RNA完全提取根据需求，自行安排。

三、 培养用耗材准备

1、 锥形瓶、双层铝箔、棉绳

2、 包扎一盒1ml的枪头，50ml康宁冻存管

四、 培养基配制(早上)

培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。

1、 按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中： 例如：配制350mlLB培养基配方如下：[配置双份] 蛋白胨 成分名称 TRYPTONE 称取质量 氯化钠 酵母提取物 去离子水 YEAST XTRACT 补足350ml 耗时评估 20min 40min 20min 3h 10min 9h 40min 13h 2、 用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、

完全、溶解。待灭菌。

五、 PBS溶液配制

1、 10XPBS不需要每次生产都配置，生产前跟检查PBS量是否充足，如充足则

可跳过该步骤。

2、 配制10XPBS缓冲液备用；例如配制1000L10XPBS储存液，取1000ml配液

瓶，根据下表称取各物质。用去离子水定容至1000ml。

名称 浓度 H2O NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 称取量 10X 1000ml 3、 将PBS溶液混合均匀，包扎好，待灭菌。

六、 灭菌

1、 将配置好的PBS溶液，培养基，1ml枪头准备好。

2、 确认灭菌锅内水位是否达到标准水位，若未达到，则加入纯化水至标准水

位。

3、 将包扎好的培养基、PBS溶液和枪头盒一同放入灭菌锅。注意PBS盖不可

太紧，盖紧灭菌锅盖，须旋紧；设置各参数：121℃，20min。

4、 灭菌结束后，待灭菌锅压力降至“0”，打开灭菌锅盖；取出灭好菌的培养

基和枪头盒。

5、 PBS、培养基放置于室温静置2h，待完全冷却。枪头盒放入80°C鼓风干

燥箱三小时烘干。备用。

6、 冷却至室温后，进行活化。

七、 菌种复苏（下班前）

1、 打开超净工作台紫外灯，紫外照射半小时，关闭紫外灯。

2、 在超净工作台内进行菌种复苏接种操作，打开50ml冻存管管盖后，用酒精

灯外焰灼烧灭菌处理冻存管管口，打开处理好的培养基瓶，用酒精灯外焰灼烧灭菌处理培养基瓶瓶口，倒10ml培养基至50ml冻存管中，用酒

精灯外焰灼烧灭菌处理培养基瓶瓶口后将培养基瓶密封待用。0

3、 吸取400μL菌种到已加培养基的50ml冻存管中，用酒精灯外焰灼烧灭菌

处理冻存管管口后盖好冻存管管盖，震荡混合均匀。

4、 标记冻存管，并培养：恒温培箱，恒温培养8h，设置参数：37℃，220r/min。

八、 接种（第二天早上）

1、 提前半小时打开超净工作台紫外灯，紫外照射半小时，关闭紫外灯。 2、 在超净工作台内进行接种操作，在开盖后及封盖前均须将瓶口或管口用酒

精灯灼烧灭菌处理。

3、 接种量为：1:100。例如：300ml培养基，取出DH5α菌种瓶，打开后用酒

精灯外焰旋转焰灼烧瓶口灭菌，吸取3ml DH5α菌种加入到培养基中，用酒精灯外焰旋转灼烧菌种瓶口灭菌后盖好盖子，用酒精灯外焰旋转灼烧培养基瓶口灭菌后盖好盖子，摇匀接种后的培养基。

4、 接种操作结束后，在培养用的器具上标注：DH5α、日期、编号。 5、 入摇床培养。（时间同菌种复苏） 6、 下班前拿出。

九、 分装培养（第三天早上）