宜宾职业技术学院
毕业论文
康宁木霉在白酒丢糟中粗纤维降解试验的研究
系 部 生物与化工工程系 专业名称 生物技术及应用 班 级 生物1102班 姓 名 黄严俊 学 号 201013207 指导教师 兰小艳
2012 年 6 月 10 日
康宁木霉在白酒丢糟中粗纤维降解试验的研究
指导教师：兰小艳
2010级生物专业 学号 201013207 姓名 黄严俊
摘要
白酒丢糟经测定含有淀粉、粗蛋白、粗纤维、有机酸等有机成分，具备生产高效牲畜饲料的优良条件，但因其粗纤维含量过高，不能生产高效的蛋白饲料。为能够合理利用白酒丢糟，本试验选用安全的、降解纤维素较好的康宁木霉接种到白酒丢糟中，利用微生物的发酵降解作用分解酒糟中的粗纤维，同时提高蛋白含量。本实验检测结果表明康宁木霉能够降解丟糟中的粗纤维，可以改善其营养组分，但在本实验设计的接近自然条件下的发酵，所产生的降解效果有待提高。
关键词：白酒丢糟；降解纤维素；康宁木霉
Trichoderma koningii in distiller's grains of coarse fiber degradation
experiment research
Tutor: Xiaoyan Lan
Professional biological 2010 No.201013207 Name: Yanjun Huang
Abstact
The determination of distiller's grains containing starch, crude protein, crude fiber, organic acid and other organic components, with the efficient production of livestock feed in excellent condition, but because of the crude fiber content is too high, not mass production using. In order to be able to reasonable utilization of distiller's grains, this experiment was safe, the degradation of cellulose better Trichoderma koningii into distiller's grains, the use of microbial fermentation degradation decomposition of lees in the crude fiber, and improved protein content. The experimental results show that the detection of Trichoderma koningii capable of degrading in distiller's grains of crude fiber, can improve its nutritional
components, but in the experimental design is close to the natural conditions of fermentation, the degradation efficiency needs to be improved.
Key words: Distiller's grains；Degradation of cellulose；Trichoderma koningii
目 录
引言 ............................................................................................................................................ 1 1材料与方法 ............................................................................................................................. 2
1.1材料与仪器 ................................................................................................................... 2
1.1.1试验材料 ............................................................................................................. 2 1.1.2试剂仪器 ............................................................................................................. 2 1.1.3菌种简介 ............................................................................................................. 3 1.2培养基 ........................................................................................................................... 3 1.3试验方法 ....................................................................................................................... 3
1.3.1菌种活化 ............................................................................................................. 3 1.3.2菌种扩大培养 ..................................................................................................... 3 1.3.3过度培养 ............................................................................................................. 3 1.3.4发酵降解 ............................................................................................................. 4 1.3.5检测方法 ............................................................................................................. 4
2实验方案设计 ......................................................................................................................... 4 3结果与分析 ............................................................................................................................. 4
3.1发酵物表观特征 ........................................................................................................... 4 3.2实验结果 ....................................................................................................................... 5
3.2.1白酒丟糟的初始值 ............................................................................................. 5 3.2.2试验粗纤维的测定值 ......................................................................................... 5 3.3结果讨论 ....................................................................................................................... 6
3.3.1培养温度的影响 ................................................................................................. 6 3.3.2密闭条件的影响 ................................................................................................. 6 3.3.3粗蛋白含量 ......................................................................................................... 7 3.4综合分析 ....................................................................................................................... 7 结论 ............................................................................................................................................ 8 致谢 ............................................................................................................................................ 9 参考文献 .................................................................................................................................. 10
引言
近年来，我国白酒行业发展迅速，特别是以泸州老窖和五粮液为代表的浓香型白酒，
产量历年上升。然而酿酒业的发展也带来了一些急需解决的问题，处理其副产品——酒糟就是其中之一。这些酒糟一般含水分较高，具有较强的酸性，易腐败变质，若不及时处理，必然严重污染环境[1～2]。经测定白酒丢糟中含有淀粉（10%左右）、粗纤维（20%左右）、粗蛋白（7%～9%）、氨基酸、有机酸、低碳糖、杂醇等有机成分[3]。从中可以检出十八中氨基酸，还含有丰富的磷、钾等无机元素及维生素等成分，还可能存在由微生物菌体产生的核糖核酸及嘌呤等微量有益成分，综合来看，酒糟作为饲料开发再利用具有得天独厚的条件。
传统的利用方法是将湿的新鲜酒糟用粉碎，加水，制得所谓“水糟”，并直接拌和其它饲料喂猪。这种方法的好处是酒糟新鲜，造价低，但其规模小，不便酒糟的储藏和运输。也存一些农民采用“土炕”烘烤酒糟的办法加工生产酒糟粉，还有的在夏天由太阳晒干一部分酒糟，虽然部分解决了储藏问题，但其规模小而且产品质量较差。目前，人们采用的酒糟饲料生产线，采用锅炉供热，自动旋烘干，旋风除尘粉碎，进口温度100℃以上，出口温度80℃左右，保证了酒糟中的营养物质不被破坏，酒糟粉粒度均匀，颜色橙黄，具面包的特殊香味（酵母烘烤后发出）。每3吨鲜酒糟可生产1吨酒糟粉，但是由于其纤维素含量高不易被降解所以投入生产很少，仅作为配料使用[4]。人们对酒糟的资源化问题已进行了多方面的研究，利用酒糟制甘油，生产食醋、香料，提取氨基酸、微量元素及植酸、植酸钙，大厌氧发酵回收沼气，提取蛋白南，生产淀粉酶，生产干全价饲料等等都已见报道，有的已投入生产。
以酒糟和粮食加工废弃物为原料，利用菌种的分解作用，经过发酵工艺的处理生产出高质量的生物蛋白饲料，可大大提高酒糟的粗蛋白含量，降低粗纤维含量，从而提高酒糟的饲料价值。对缓解我国饲料原料紧张局面，推动饲料工业和畜牧业的发展具有广泛的前景。通过微生物发酵不但可以提高蛋白含量，解决蛋白资源匮乏的问题，而且能够改变饲料中蛋白质结构、氨基酸比例，可以将无机氮、植物蛋白转化为菌体蛋白。发酵后饲料中含有丰富的维生素、多种微生物酶、生物活性物质及生长调节剂，蛋白质含量高，动物容易吸收，营养平衡，解决了目前配合饲料中营养水平低，吸收效率不高的问题。针对这种情况，本文选用降解纤维素较好的木霉属康宁木霉[5]进行降解实验，以探究对白酒丢糟中纤维素的降解情况。
1
1材料与方法
1.1材料与仪器 1.1.1试验材料
实验所用菌种名称康宁木霉（Trichoderma koningii），来源于中国工业微生物菌种保藏中心（China Center of Industrial Culture Collection,CICC）,CICC编号为40852；白酒丢糟，由四川省宜宾叙府酒业提供；麸皮为市售。 1.1.2试剂仪器
试验试剂：酒精、硫酸、氢氧化钠、硼酸、混合催化剂、混合指示剂、无水乙醇、盐酸标准液、蔗糖、硫酸铵、硼酸吸收液
实验仪器：高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、干燥箱、分析天平、古氏坩埚、真空泵、电炉、凯氏定氮仪、滴定管、容量瓶（详见表一）
表一实验器材
试剂/仪器 酒精 硫酸 混合催化剂 氢氧化钠 硼酸 混合指示剂 盐酸标准溶液
蔗糖 硫酸铵 硼酸吸收液 加湿恒温培养
箱 超净工作台 分析天平 容量瓶
规格/型号 95%
浓度为98％、0.127 mol/L 0.4gCuso4.5H2o，6g硫酸钾
40％水溶液 2％水溶液
甲基红0.1％乙醇溶液，溴甲酚绿0.5％乙醇溶液，两溶液等体积混合
0.1mol/L、2mol/L、0.313 mol/L
分析纯 分析纯，干燥
1％硼酸水溶液1 000mL，加入0.1％溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1％甲基红乙
醇溶液7mL，4％氢氧化钠水溶液0.5mL，混匀
SPX-250-C智能型恒温恒湿培养箱 SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台
感量0.0001g 100mL、250mL
2
1.1.3菌种简介
康宁木霉（Trichoderma koningii）：化能异养；嗜温；趋酸；兼性厌氧。产纤维素酶，分解纤维素能力强。察氏琼脂培养基30℃培养 7天，菌丝体生长快，菌落较大近圆形、绿色、表面紧密似毯状、边缘白色絮状。分生孢子近球形、椭圆形至近椭圆形、浅色至绿色，2.55-4.10µm或2.87-4.46×3.46-5.62µm。培养温度25-30℃，最适PH生长范围为4.5-5.5。中国农业部准许使用的安全、高效菌株。 1.2培养基
马铃薯培养基［6］：取去皮的马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分,钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟。
过度培养基：以马铃薯培养基为基础加入少量麸皮。 丟糟培养基：以调整后的白酒糟为原料。 1.3试验方法 1.3.1菌种活化
马铃薯固体培养基→灭菌→倒入斜面试管→无菌接种康宁木霉→培养（恒温30℃、3d）
1.3.2菌种扩大培养
马铃薯培养基→分装三角瓶→灭菌→倒平板→接种（活化菌）→培养（25℃、3d） 1.3.3过度培养
为菌体能够更好地适应丟糟环境，取得最佳的降解效果，特选用过度培养基，对菌种进行驯化[7]：马铃薯培养基→加入少量麸皮→分装三角瓶→灭菌→倒大试管斜面→接种→培养（25℃、5d）
注：为达到驯化的目的而又不过度影响菌种生长，特选用接近酒糟的麸皮作为过度培养基中的添加物。
3
1.3.4发酵降解
将大试管斜面内培养好的生长状况良好的绿色菌种用少量无菌水洗涤，制成100ml均匀的菌悬液，按一定比例接种到装有经过降酸处理的白酒丟糟的无菌培养瓶中，混匀，在不同环境条件下进行培养，时间为30天。在发酵降解期间，定期测定各编样中干物质的粗纤维含量，与接菌前白酒糟干物质的粗纤维含量作比较。（由于该菌的最适PH生长范围为4.5-5.5，而测得酒糟酸度为3.5左右，因此在每个培养瓶中滴入适量氢氧化钠溶液，混匀，调整其PH以达到菌种生长的范围） 1.3.5检测方法
水分含量：恒重法；pH测定：精密pH试纸；纤维素含量：酸碱处理法[8]；蛋白质含量：凯氏定氮法[9]。
2实验方案设计
表二 发酵方案
编号（#）
1 2 3 4 5 6 7 8
接菌量（%）
5 5 5 5 10 10 10 10
温度（℃）
25 25 18-30 18-30 25 25 18-30 18-30
是否密闭 是 否 是 否 是 否 是 否
3结果与分析
3.1发酵物表观特征
实验发现，康宁木霉培养时，观察到前期生长缓慢，后经过多次活化扩大培养，菌
4
丝体生长转快，菌落较大近圆形、绿色、表面紧密似毯状、边缘呈白色絮状。在后期发酵降解试验中将培养好的康宁木霉洗脱菌液接入糟醅后，前五天糟醅无明显变化，五天后糟醅颜色逐渐变深为褐色，骨力逐渐减弱，用手可以清晰感觉到变粘变软，并在样品中生长出绿色菌体，大量分布在培养瓶底部和糟醅表面。到后期，变化愈加明显，烘干以后更加松脆。另外，放在自然环境中培养的样品中混入环境中的其它杂菌呈灰白色，从观察检测来看，初步确定为与白地霉同属菌类，该菌与实验用菌不产生拮抗作用，并共同作用于糟醅，使降解效果更加明显。 3.2实验结果
3.2.1白酒丟糟的初始值
表三 酒糟初始值
项目
水分
粗纤维
粗蛋白
总酸
其它物质
含量（%） 62 24.32 8.21 3.55 1.92
3.2.2试验粗纤维的测定值
在接入菌体后，每隔五天对样品进行测定，仔细观察各组纤维素含量的变化，避免其它未知因素影响试验降解效果，其测定定结果如表四：
表四 粗纤维含量（干重）
编号
1
时间 0天 5天 10天 15天 20天 25天 30天
2 24.29% 24.20% 23.21% 22.10% 21.64% 20.29% 19.00%
3 24.34% 24.16% 23.43% 22.15% 21.12% 20.33% 19.34%
4 24.32% 24.06% 23.03% 21.97% 20.61% 19.98% 19.05%
5
5 24.35% 23.42% 22.75% 20.13% 19.21% 18.67% 18.33%
6 24.30% 23.50% 22.66% 20.23% 19.05% 18.72% 18.87%
7 8
24.31% 24.10% 23.52% 22.04% 21.17% 20.64% 19.17%
24.31% 24.33% 23.27% 23.30% 22.82% 22.72% 20.55% 20.02% 19.42% 19.13% 18.49% 18.95% 18.27% 18.03%
在测定试验中发现，发酵时间越长，接菌量越大，在消化后得到的残留物也越少，残留物颜色也更加浅，趋近于全为稻壳，灰化时间也逐渐缩短。 3.3结果讨论 3.3.1培养温度的影响
从表四及下图得知在同等条件下，相同温度的样品相互之间并无明显差距，温度的恒定与否对菌体作用丟糟无明显影响，只需要维持一定的自然温度环境即可，对温度的控制没有严格的要求，这符合工业生产的成本节约，最大利益化。
图 样品粗纤维含量 25.00% 24.00% 23.00% 22.00% 粗纤维21.00% 含量20.00% 19.00% 18.00% 0天 5天 1 2 3 4 5 6 7 8 3.3.2密闭条件的影响
实验结果证明，相对来说，在自然环境中生长要比在密闭的环境中生长要好。1、2号样品，3、4号样品，7、8号样品均可清晰观测到。两者比较，后者均要比前者多下降0.2-0.7个百分点。分析5、6号不符的原因有几点，测量误差，有其它未知杂菌感染，导致结果与其他各组有偏差。自然培养的优良生长态势是工业生产必须要求的，免
%
10天 15天 时间 20天 25天 30天
6
除维持密闭条件所产生的成本增加。 3.3.3粗蛋白含量
表五 粗蛋白含量（干重）
编号 含量
1 9.62%
2 9.77%
3 9.48%
4 9.66%
5 9.97%
6 10.04%
7 10.33%
8 11.00%
发酵培养结束后，将所得糟醅烘干后用凯氏定氮法测量其蛋白含量，测得各样蛋白含量均有所上升，虽增量不多但效果良好，有一定的增进。全部样品均上涨4-5个百分点，基本达到了预期效果。
根据实验室实际情况，粗蛋白测定实验选用马氏定氮装置，但此只对实验操作方便性有关，而对实验结果数据的准确性无影响。 3.4综合分析
本实验选用的丢糟取自于叙府酒业，该材料由大米、玉米、糯米、小麦、高粱五种粮食组成，再混入糠壳，属于多粮型白酒丢糟，与以往所研究的以高粱等单一粮食为原料的单粮型丢糟有所不同，它具有其特殊性和典型性。因此该实验数据与同类研究的文献资料记载有所差异，通过对本实验酒糟样品的检测，初步可以判断，康宁木霉对白酒丟糟有降解作用，可以下降5个百分点，虽经过一些处理，但实验效果还是比较差，未达到高效生物蛋白饲料标准。本实验数据反映该菌改善白酒丟糟营养组分，具有一定的经济适用价值。同时，实验中自然环境与特定生长条件相比较，在自然条件下收到的效果更佳，对大规模工业生产降低了限制，节约了生产成本，可以在自然条件下进行常规的生产工作，且不影响产品品质和得率。
7
结论
通过康宁木霉发酵降解白酒丟糟的试验，经测定培养后的丟糟粗纤维素、粗蛋白与初始值相比较，初步结果表明，康宁木霉能够降解丟糟中的粗纤维，可以改善其营养组分，但在本实验设计的接近自然条件下的发酵，所产生的降解效果有待提高。
分析实验效果较差原因：其一，实验材料特殊性，属于多粮型白酒丢糟，与康宁木霉生长所需要的最适生理生化条件差异较大；其二，菌种活化不够，接入菌体不强壮，只有活力较旺盛的菌株易生长；其三，实验条件限制，特别是未添加任何营养液，但也为工业生产奠定基础。
虽降解有限，但仍为工业化生产提供数据。若需取得更加明显效果，有待进一步深入研究。考虑其生长成本的条件下，增加菌种活化次数，对发酵条件进行优化，糟醅中加入成本较低的麦麸皮，添加营养液，加大菌体接入量并尝试利用多种菌混合发酵，严格控制发酵可控因素，通过不同菌的相互协调作用更加充分发酵分解粗纤维生成粗蛋白，取得的降解效果将更加明显准确。
8
致谢
本文是在兰小艳老师的精心指导下和支持下完成的。在此，向她表示衷心的感谢！另外，还要感谢周宇科、林永露两位老师在百忙之中能抽出时间对我的指导，最后感谢帮助和支持我的各位同学，由于他们的支持我才能顺利的完成论文。
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参考文献
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