剑麻根际联合固氮菌的分离及固氮活性测定

陈河龙;李庆洋;易克贤;高建明;郑金龙;刘巧莲;张世清

【摘 要】通过选用NFM、CCM、Ashby及改良的Dobereiner培养基,利用气相色谱仪(GC)对海南省昌江县、广西扶绥县和广东雷州市三地剑麻种植基地的剑麻根际联合固氮菌进行分离、纯化及利用乙炔还原法进行固氮活性测定,获得50株具有固氮活性的菌株,其固氮酶活性最高的菌株是ASN004,固氮酶活性为1 765.659 0 nmol/(mL·h),具有开发利用的潜力.%The associative nitrogen fixation bacteria in sisal rhizosphere, sampled from Changjiang County in Hainan Province, Fusui County in Guangxi Zhuang Autonomous Region and Leizhou City in Guangdong Province, were isolated and purified by Gas Chromatography on the NFM, CCM, Ashby and modified Dobereiner medium. And their nitrogen -fixing activity was measured by acetylene reduction method. The result indicated that, 50 bacterial strains had nitrogen -fixing activity. And a bacterial strain No. ASN004 with the highest nitrogenase activity of 1765.6590 nmol/(mL·h) was found and it had good exploitation potential. 【期刊名称】《热带作物学报》 【年(卷),期】2011(032)006 【总页数】5页(P1097-1101)

【关键词】剑麻;根际;固氮菌;乙炔还原法

【作 者】陈河龙;李庆洋;易克贤;高建明;郑金龙;刘巧莲;张世清

【作者单位】中国热带农业科学院热带生物技术研究所,农业部热带作物生物技术重点开放实验室 海南海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,农业部热带作物生物技术重点开放实验室 海南海口 571101;海南大学农学院,海南儋州571737;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,农业部热带作物生物技术重点开放实验室 海南海口 571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南儋州571737;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,农业部热带作物生物技术重点开放实验室 海南海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,农业部热带作物生物技术重点开放实验室 海南海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,农业部热带作物生物技术重点开放实验室 海南海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,农业部热带作物生物技术重点开放实验室 海南海口 571101

【正文语种】中 文

【中图分类】S154.38+1;S563.8

自1958年巴西学者Dobereiner和Ruschei等首次从热带禾本科作物甘蔗的根际分离到具有固氮能力的细菌—拜叶林克氏菌（Beijerinckia fluminensis）以来，人们对非豆科植物与根系联合的特殊固氮菌展开了广泛研究[1]。至今，报道具联合固氮能力的禾本科植物至少有40属100种[2-5]。经检索以及查阅相关资料，关于剑麻根际联合固氮方面的研究尚未见报道。

剑麻是热区重要的纤维作物，广泛应用于渔业、航海、工矿、运输、油田、制药、饲料、肥料等行业,以及用于编织剑麻地毯、剑麻特种布、造纸、过滤器、工艺品、抛光轮等，综合利用前景广阔。目前我国剑麻种植面积3万多hm2，主要分布在广东、广西和海南，剑麻种植地土壤较为贫瘠，因而需要施用大量的氮肥和有机肥

料。基于生产上的需求，本研究通过对剑麻根际联合固氮菌的分离、筛选和鉴定，希望获得高效优良固氮菌株，为进一步制备剑麻固氮微生物肥料，以及降低剑麻生产成本奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料

本研究的实验材料为剑麻根际土壤样品和根样品，分别采自海南省昌江黎族自治县十月田南迪公司剑麻种植基地、广西壮族自治区扶绥县山圩农场剑麻种植基地和广东省雷州市东方红农场剑麻种植基地，3基地的剑麻品种均为H.11648，所采集的样地种植剑麻年限均在10 a左右。 1.2 方法

1.2.1 取样 选定样地，采用随机取样法采集生长健康的剑麻根际土壤样品和根样品。在每个标准样地内按 “S”形随机选择15株剑麻，采集根际土样时先去除表层的杂物和杂草，然后在剑麻植株的根部一侧小心的挖掘一个长宽均为30 cm，距地表深度为30 cm的坑，让植株一侧的根系裸露，然后用小铲子轻轻刮取黏附在根系表面约2 mm左右的土壤，并用剪刀剪下部分须根；采集非根际土样时取同一地块远离植株根系的土壤[6]。将15株剑麻根际土样、根样及非根际土样各分成3份（每份为5株剑麻的混合样），并装入经高压消毒的无菌封口袋中封好并贴上标签，置于事先准备的冰盒带回实验室，在24 h内处理和测定。 1.2.2 联合固氮菌的分离与纯化

（1）培养基的选择：选用NFM、CMM、Ashby、改良Dobereiner无氮培养基分离、纯化土样和根样中具有固氮能力的细菌类群,并用LB斜面培养基4℃保存，培养基成分见参考文献[7-9]。

（2）联合固氮菌的分离与纯化：为便于研究,将根际区分为:距根系较远（1 cm）土壤（NRS）、根表土壤（RS）、根系表面（RP）和根内（HP）[6]；剑麻根际

联合固氮菌的分离与纯化方法参考Hafeez FY[10]、田宏[3]和田颖[11]的方法。 1.2.3 利用乙炔还原法对菌株进行固氮酶活性测定

（1）操作步骤：将已纯化的菌株再次分别接入盛有NFM、CCM半固体培养基和Dobereiner液体培养基的试管内，密封后，置于温度为28℃，湿度为85%的人工培养箱内进行培养[10]（待24～48 h后，向10 mL试管内注入1%体积的乙炔气体，在同样条件的人工培养箱内培养24 h，测定其固氮酶活性（测定仪器为北分SP-2100气相色谱仪）。

（2）计算方法：固氮酶活性计算方法参照文献[7]。 2 结果与分析

2.1 剑麻根际联合固氮菌的分离、纯化

实验结果表明，Hafeez F Y和田宏的方法对NRS、RS、RP固氮菌的分离效果较好。而对HP固氮菌分离效果分别见表1、2。

从表1可以看出，在 3处样品采集地54个处理中，每地只有一个处理能培养出少量的菌群，田宏的方法对HP处理的效果不明显，所分离到的菌群较少。此外，在实验过程中，通过对昌江和扶绥的样品处理后HP固氮菌分离效果不明显，故而在雷州的样品处理时把菌液浓度从10-4、10-5、10-6分别提高至浓度为10-2、10-3、10-4，但是接种培养结果没有什么变化，分离效果仍然较差。

从表2可以看出，采用田颖的方法成功培养获得的固氮菌群落比较多，分离效果较好，扶绥样品的分离效果要好于昌江和雷州的样品分离效果。在菌液浓度10-4时，昌江、扶绥和雷州的样品都分离到30个单菌落以上；而在菌液浓度10-5时，昌江和雷州的样品分离到10～30个单菌落，扶绥的样品都分离到30个单菌落以上；在菌液浓度10-6时，昌江和雷州的样品分离到1～10个单菌落，扶绥的样品都分离到10～30个单菌落以上。

表1 HP菌株处理一说明：-表示没有分离到菌株，+表示分离到1～10个单菌落。

取样地区 菌液浓度CCM培养基重复1 重复2 重复3 重复1 重复2 重复3 NFM培养基海南昌江10-4 - - - + - -10-5 - - - - - -10-6 - - - - - -广西扶绥10-4 - - - + - -10-5 - - - - - -10-6 - - - - - -广东雷州10-2 - - - + - -10-3 - - - - - -10-4 - - - - - -

表2 根内（HP）菌株处理二说明：+表示分离到1～10个单菌落，++表示分离到10～30，+++表示分离到30个单菌落以上。? 2.2 剑麻根际联合固氮菌酶活性测定

剑麻根际菌株酶活性测定结果如表3-1和表3-2所示，并据此绘制固氮酶活性测定结果图、菌株来源部位固氮酶活性比较图、不同采集地菌株数量和固氮酶活性比较图、不同培养基培养固氮酶活性比较图。

在51株固氮菌株中50株具固氮酶活性，只有1株没有固氮酶活性（图1）；其中固氮酶活性在100 nmol/（mL·h）以下的菌株有11株，固氮酶活性在1 000～100 nmol/（mL·h）之间的有27株，而固氮酶活性达到1 000 nmol/（mL·h）以上的有12株，固氮酶活性高于何福恒等[2]从水稻、玉米、甘蔗根际分离获得的固氮菌固氮酶活性分别为2～819、880～894、299～934 nmol/（mL·h），远高于田宏等[3]从草坪草根际分离的固氮菌活性37.78～180.20 nmol/（mL·h），以及田颖等[11]从小麦根际分离到的固氮酶活性30.14～100.77 nmol/（mL·h），从而表明了从剑麻根际分离到的菌株具有较高的固氮酶活性。

图1 固氮酶活性测定结果柱形

表3-1 剑麻根际菌株固氮酶活性测定结果菌株编号 菌株采集地 菌株来源部位 培养基 固氮酶活性/[nmol/（mL·h）] ASN004 CJ HP Ashby1765.659 0 ASN006 CJ HP Ashby1598.687 8 ASN023 FS RS CCM1575.921 1 ASN037 ZJ HP Ashby1300.145 1 ASN001 CJ HP Ashby1252.794 9 ASN030 FS HP

Ashby1220.123 2 ASN021 FS HP Ashby1195.902 2 ASN020 FS HP Ashby1140.435 0 ASN002 CJ HP Ashby1120.918 1 ASN003 CJ HP Ashby1065.677 2 ASN012 CJ RS CCM1055.354 4 ASN009 CJ NRS CCM1014.658 5 ASN042 ZJ RP CCM 993.501 1 ASN033 FS NRS NFM 987.7787 ASN019 FS HP Ashby 920.074 3 ASN035 ZJ HP Ashby 876.329 9 ASN022 FS NRS CCM 853.325 9 ASN050 ZJ RS CCM 824.057 9 ASN010 CJ RP NFM 650.144 2 ASN038 ZJ NRS CCM 602.579 3 ASN044 ZJ RS CCM 530.131 3 ASN005 CJ HP Ashby 443.725 9 ASN008 CJ HP Ashby 418.958 5 ASN028 FS HP NFM 397.810 6 ASN049 ZJ RS NFM 366.590 3

不同菌株来源部位，固氮菌数量和固氮酶活性强弱有所差异，其顺序为：HP＞RS＞NRS＞RP（图2）。这与田宏[3]研究结果有差别，禾本科草坪草固氮菌株来源以RS和RP较多，HP和NRS相对较少。

表3-2 剑麻根际菌株固氮酶活性测定结果说明：CJ表示菌株采集地为海南昌江，FS表示菌株采集地为广西扶绥，ZJ表示菌株采集地为广东雷州。菌株编号 菌株采集地 菌株来源部位 培养基 固氮酶活性ASN017 FS HP Ashby 354.123 0 ASN025 FS RS CCM 313.220 5 ASN027 FS RS CCM 306.657 0 ASN043 ZJ RP NFM 285.341 9 ASN046 ZJ RS CCM 254.750 4 ASN007 CJ HP Ashby 243.258 7 ASN014 CJ RS CCM 222.316 8 ASN024 FS RS NFM 164.474 7 ASN015 CJ RS CCM 139.736 6 ASN018 FS HP Ashby 133.475 0 ASN048 ZJ RS NFM 133.0246 ASN041 ZJ RP CCM 118.534 7 ASN031 FS NRS NFM 113.680 4 ASN026 FS RS CCM 100.394 9 ASN040 ZJ RP NFM 98.534 7 ASN039 ZJ NRS CCM 88.918 3 ASN045 ZJ RS CCM 87.942 4 ASN013 CJ RS NFM 87.849 9 ASN032 FS NRS CCM 60.200 2 ASN047 ZJ RS NFM 49.507 8 ASN011 CJ RP CCM 40.477 6 ASN029 FS HP CCM 25.203 2 ASN036 ZJ HP

Ashby 5.874 2 ASN016 FS HP Ashby 4.439 3 ASN034 ZJ HP Ashby 1.800 2 ASN051 ZJ RS CCM 0.000 0

图2 菌株来源部位固氮酶活性比较柱形

不同菌株采集地的菌株数量和固氮酶活性有所差异，海南昌江的菌株固氮酶活性比较高，广西扶绥的次之，而广东雷州的比较低（图3）。这也许与采集地的土壤类型C/N比、温度、湿度和氧气分压等多种因素相关。 图3 菌株采集地菌株数量和固氮酶活性比较

不同培养基培养效果同样有所差异，培养菌株数量和固氮酶活性效果最好的为Ashby培养基，其次为CCM培养基，最差的培养效果为NFM培养基（图4）。而在何福恒等[2]研究中，以慢型快长根瘤菌培养基最好，其次是琥珀酸钠盐和苹果酸钾盐培养基，修改伯克氏培养基没有分离到有明显酶活的菌株。 图4 不同培养基培养菌株固氮酶活性比较 3 讨论与结论

从剑麻根际分离出来的菌株基本上都具有固氮能力，根际不同部位固氮菌的数量有所差异，分离到的菌株多数来自HP（42%）和RS（34%），来自NRS和RP的分别仅占14%和12%。这与姚拓等[12]分离燕麦根际固氮菌时各分布部位不同，其分布呈RP＞RS＞NRS≥HP趋势。分布趋势与固氮菌在不同部位所处生态位和菌株本身属性有关。剑麻根际固氮菌活性在1765.659 0～1.800 2 nmol/（mL·h）之间，相差较大，其中12株固氮酶活性达到1 000 nmol/（mL·h）以上，ASN004菌株固氮酶活性达到1 765.659 0 nmol/（mL·h），ASN034菌株固氮酶活性仅有1.800 2 nmol/（mL·h）。ASN004菌株固氮酶活性比姚拓·等[12]的燕麦根际CHO3菌株固氮酶活性1 147.9 nmol/（mL·h）、何福恒等[2]水稻根际固氮酶活性819nmol/（mL·h）、玉米根际固氮酶活性894 nmol/（mL·h）、甘蔗根际固氮酶活性934nmol/（mL·h）高，远高于田宏等[4]的草坪草根际固氮酶

活性180.2 nmol/（mL·h）、田颖等[11]小麦根际固氮酶活性100.77nmol/（mL·h），这也许与固氮酶活性受植物种类、土壤类型（有机质含量影响植物根系固氮酶活性）、C/N比、温度、湿度和氧气分压等多种因素影响有关。 本研究从剑麻根际分离出较多优良固氮菌株，具有较高的固氮酶活性，具有作为生物氮肥的开发潜力，为制备生物菌肥奠定了良好的基础。但是由于试验条件和时间的限制，一些重要的菌株生物学特性和生理生化机理有待深入研究。此外，较高固氮酶活性的菌株和较低固氮酶活性的菌株并不呈规律性的出现，在同一来源地和来源部位共存此两类菌株，菌株的固氮酶活性与什么因素直接相关尚待进一步的研究。 参考文献

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