蛋白质测定方法比较与研究进展

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江　西　化　工2007年第2期　

蛋白质测定方法比较与研究进展

乐　萍　雷　颉　熊建铭

(南昌理工学院,江西,南昌,330006)

摘要:蛋白质是生物体中含量最高,功能最重要的生物大分子,与生命的起源和进化都密切相关,因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究,一直是化学家及生物学家极为关注的问题,其含量的测定在生化分析和临床分析中具有重要意义,研究和开发新的、高灵敏度的蛋白质测定方法是生物化学研究的一个活跃领域

本文综述了近年来蛋白质测定的方法的研究进展,包括分光光度法、双缩脲法、凯氏定氮法、电泳分析法、质谱分析法在蛋白质测定中的应用。总结各种方法的特点及适用条

件。质谱分析是测定结果最准确的测定方法;凯氏定氮法适用范围最广泛,分光光度法是最为简便快速的测定方法。

关键词:分光光度法　　凯氏定氮法　　质谱分析　　蛋白质　　测定

　　蛋白质在生物体内占有特殊的地位,它和核酸是构成原生质的主要成分,是生命现象的物质基础。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。作为生命的物质基础之一,蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用。蛋白质的分离与定性、定量分析是生物化学和其他生物学科、食品检验、临床检验、疾病诊断、生物药物分离提纯和质量检验中最重要的工作。

目前测定蛋白质含量的方法有很多种,本文就常见的分光光度法、凯氏定氮法以及电泳和质谱分析法进行讨论1　分光光度法

分光光度法以分子吸收光谱为基础,设备简单,结果准确直观

双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ml)作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白

质浓度。

此方法对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便,但灵敏度不高,约为1mg,故现在已很少使用。

孙建平等[1]认为传统双缩脲法的测定结果毕凯氏发小约10%-20%,绝对误差的平均值达到1g/100g以上;双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响,采用0.5g样品,40ml双缩脲试剂的比例具有较高的检测精度。

1976年,Bradford提出了一个灵敏、快速定量测定微克量蛋白质的方法,即现在广泛使用的考马斯亮蓝法(CBBG-250)。当染料考马斯亮蓝与蛋白质结合后,其最大吸收波长从465nm变为595nm,且在595nm处吸光度的增加与蛋白质的量呈线性关系,可用于蛋白质的测定。此方法重现性好,染料与蛋白质的结合反应在两分钟左右即可完成且一个小时内基本稳定。钠离子、钾离子、镁离子、铵离子、乙醇和碳水化合物如蔗糖对体系无干扰或有微弱干扰。在强碱性缓冲溶液颜色较弱,但是通过选择合适缓冲溶液可得到满意结果。

我国分析工作者在蛋白质得分光光度法的研究中取得了显著的成就。北京大学的童沈阳研究组对一些染料与蛋白质的作用机理进行了探讨,并提出了测定蛋白质的新方法。他们用分光光度法研究了溴甲酚绿(BCG)与牛血清白蛋白(BSA)在酸性溶液中的结合反应,认为BCG与BSA主要由于静电引力而结合,疏水作用力对结合反应也有影响。发现溶液酸度,离子强度对颜色反应有显著影响。2　凯氏定氮法

将蛋白质样品在硫酸铜的催化下,用氧化性试剂

消化分解转化为铵离子,然后将含有铵试液置于蒸馏瓶中,加高浓度碱使铵离子转化为氨,再加热蒸馏,用

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过量的标准硼酸溶液吸收氨气,再用盐酸标准溶液滴定H2BO3,以甲基红作为指示剂。通过计算铵离子的量计算蛋白质含量。

凯氏定氮法测定结果准确,重现性好,但操作复杂费时,试剂消耗量大;

李宁[2]认为凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法,适用样品广泛,测试结果准确。

王雅[3]认为凯氏定氮法样品的最佳消化条件为GuSO4·5H2O2.50g,K2SO40.10g,浓H2SO44.00ml;GuSO4·5H2O的用量为影响消化时间的主要因素,K2SO4和浓H2SO4用量为第二和第三主要因素;用此最佳条件作试验,消化时间仅为12min;与其他GuSO4·5H2O、K2SO4、浓H2SO4用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。

邓小超等[4]认为:对凯氏定氮装置进行了改进,用高压锅做水蒸气发生器,串连几套定氮仪,可同时测定几份样品。节省时间,提高了工作效率。改进后的方法适用于批量食品蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。3　电泳法

蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

近年来蛋白质凝胶电泳技术在国际上迅猛发展,已成为高分辨(等电聚焦,0.001pH),高灵敏度(银染色,荧光染色,ng级)和获得大量信息(双向电泳,近万个点)的现代技术。如以固相pH梯度等电聚焦(IPGIEF)为第一向的双向电泳是当前研究重要生命现象和主要疾病病因的蛋白质组分析所必须的开门技术。该电泳已经不仅局限于作为基础理论研究的工具,而且与国民经济的发展越来越密切。如农、林、牧、渔优良品种的定向培育,食品的鉴定、保鲜和加工;医学中的临床诊断;基因工程药物的开发和质量控制等。

蛋白质的样品制备是WesternBlotting的第一步,样品制备是关键步骤,要求尽可能的获得所有蛋白质,应注意以下问题:在合适的盐浓度下,应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性;选择合适的表面活性剂和还原剂,破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键,使其形成一个各自多肽的溶液;尽量去除核酸,

多糖,脂类等干扰分子。

唐萍等

[5]

产生影响。采用P/ACEMDQ毛细电泳仪、涂层毛细管柱:40cm＊50μmI.D.有效长度为36cm时,在20mmol柠檬酸缓冲液(PH=3.0)、温度40℃、电压20KV的电泳条件下,经样品缓冲液稀释的奶样品在20min内获得了较好的分离。实验验证毛细管电泳法准确、快速、无污染,为牛奶的质量监控和奶粉的配方改善提供了一个新的途径。4　质谱法

蛋白质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子,复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级,三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋白质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。

以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析,由于新的离子化技术的出现,如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化,各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是:通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值,分析鉴定未知蛋白质。近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种:电喷雾电离质谱;基质辅助激光解吸电离质谱;快原子轰击质谱;离子喷雾电离质谱;大气压电离质谱。在这些软电离技术中,以前面三种近年来研究得最多,应用得也最广泛。

质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点:很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息,能最有效地与色谱联用,适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定,同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。

在蛋白质的质谱分析中,质谱的准确性(accuracy)对测定结果有很大影响,因此质谱测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点,这些都非常适合于现在科学研究的需要。我们相信,随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进,蛋白双向电泳的应用[16]以及质谱技术的不断完善,质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一

1981年首先采用FAB双聚焦质谱测定肽分子量,分析十一肽(Mr=1318),质谱中出现准分子离子[M+1]+=1319强峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白质合适用FAB质谱分析,更大分子量的多肽和蛋白质可用MALDI质谱或ESI质谱分析。用MALDI-TOF质谱分析蛋白质最早一例是HillenKramp等[6]于1988年提出用紫外激光以烟酸为基质在TOF谱仪上测出质量数高达60kDa蛋白质,精确度开始只有0.5%,后改进到0.1

运用毛细管电泳法测定奶制品中蛋白质

含量,采用柠檬酸体系对牛奶中α-乳白蛋白、β-乳球

蛋白、α-酷蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白五种蛋白进行分离,认为缓冲液PH值、运行电压均会对蛋白质分离52

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学报.2006;26(2);132-134

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-0.2%。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量,也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究[7,8],三条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。近年来,串联质谱分析仪发展迅猛,其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高,大规模数据库和一些分析软件(如:SEQUEST)的应

用使得串联质谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前,利用2D电泳及MS技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析,已经鉴定出1484种蛋白质,包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质

[9]

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;分析肝细胞癌患者血

清蛋白质组成分[10],并利用质谱进行鉴定磷酸化蛋白研究工作[11]及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白(SDNP)的分子结构[12]等。

综上所述:质谱分析是测定结果最准确的测定方

法,肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点,但是质谱的准确性(accuracy)对测定结果有很大影响,因此质谱测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定;

凯氏定氮法适用范围是目前分析含氮化合物最常用的方法,适用样品范围广泛、测试结果准确;分光光度法是最为简便快速的测定方法,过程简单迅速,但灵敏度不高。

参考文献

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Acomparisonandprogressofanalysisondeterminingmethods

towardsprotein

Yueping　LeiJie　XiongJianming

Abstract:Proteinisthemostimportantpartsandthemostfunctionalmicroorganismoflife,thelifeorigin,theexistenceandtheevolutionallmakescloserconnectionwiththeproteins.Chemistandbiologisthavealawaysfocusedonthestudyofproteinsanaly-sis,theproteindeterminationhasrelationtothebiochemistryandclinicanalyse.Thestudyofnewproteindeterminationmethodwhichhashigherprecisionisthe

Thisarticlereviewsthedevelopmentofproteindeterminationmethodinrecentyears.includingtheapplicationsofspectropho-tometry、biuretreactionanalyticalmethod、Kjeldahldeterminationmethod、electrophoresisandmassspectrometry.accordingtocomparingthecharacteristicandapplicabilityofeachmethod,wecanconclude:themassspectrometryisthemostaccuratemethod,theKjeldahldeterminationmethodismostsuitable,andspectrophotometryisthemostsimpleandrapidmethod.Keywords:spectrophotometry　　Kjeldahldeterminationmethod　　electrophoresis　　massspectrometry　　protein　　determination