中国实验动物学报
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\"\"\"\"#研究进展
\"#\"#小鼠肝癌模型研究进展
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李顺，陈丽香，彭秀华，诸蒋鸣，周晓辉
(!1上海市公共卫生临床中心，上海%’!(’F;%1苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏%!(!%#)&摘要’肝癌至今仍是全球高死亡率癌症之一$动物模型特别是小鼠模型是研究肝癌生物学特性#发病机制#新药筛选和治疗的重要工具$近年来，各种小鼠肝癌模型的发展在一定程度上促进了肝癌的相关研究，但是现有模型都有一定不足$缺乏与人类肝癌高度相似且经济适用的动物模型严重制约着对肝癌的深入研究$随着基因修饰技术的发展，小鼠肝癌模型的构建更加快速#容易和方便$本文拟对用于肝癌研究的各种小鼠模型进行概述，并着重强调基因修饰小鼠肝癌模型的构建，以期为相关癌症基因功能研究#应用基因编辑技术研发肝癌模型提供新思路和方向$
&关键词’肝癌;基因修饰;小鼠模型&中图分类号’L\"(+##
&文献标识码’P
&文章编号’!’’(+&F&)(%’!$)’%+’%!#+’&
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(!1I4-A94-.S?B/.2_D-/54K/.A.2-/KDA5D@，I4-A94-.%’!(’F，K4.A-，%1I2433/3VZ-:.2XD<.2-/-A &!862>7J2’W.‘D@2-A2D@@D,-.A:3AD3V54D/D-<.A92-?:D3V2-A2D@ 第六大死亡率癌症，已经严重威胁到人类健康和生［!］ 命$全球每年约有)’’’’’新发肝癌患者和近$’’’’’患者死于肝癌［%］$我国是全球肝癌发病率最高和死亡数最多的国家，其肝癌患者约占全球的((i$肝癌患者的(年平均存活率低于!!i［#］$虽然流行病学研究表明，乙型肝炎病毒(4D6-5.5.:Z‘.@?:，_Zb)和丙型肝炎病毒(4D6-5.5.:K‘.@?:， _Kb)感染#黄曲霉素#酒精#亚硝胺类物质等都与 ［&］ 肝癌发病有关$然而，具体的肝癌发生的分子机制和通路仍尚未清楚，构建更加合适的可用于人类肝癌研究的动物模型有助于解决该问题$小鼠的遗传物质和人非常相似，且构建小鼠模型成本较低#周期较短#基因修饰技术更容易实现，因此小鼠是可用 ［基金项目］国家重点基础研究\")#发展计划项目(%’!%KZ(!\"’’();上海市科技发展基金实验动物研究项目(!(!&’\"’&’’’);上海市卫生和计划生育委员会科研课题项目(%’!(&]’’)()! ［作者简介］李顺(!\"F$E)，*+,-./:/.:4?AF$0!%$123,$男，助理研究员，博士，从事基因修饰动物模型研究，［通讯作者］*+,-./:843?C.-34?.0:4-64213@9$周晓辉(!\")#E)，博士，男，研究员， \"\"\"\"#%!& 中国实验动物学报%’!$年&月第%&卷第%期 ［(］ P25-W-BPA.,I2.I.A，P6@./%’!$，b3/1%&GJ31% 于人类肝癌研究较好的模型动物$构建可准确 模拟人类肝癌症状#又易于获取#经济适用的小鼠模型不仅有助于深入探究肝癌发生和发病的分子机制，还可用于检测和评估新的肝癌治疗方法和手段，开发新的肝癌医学影像技术和相关药物等，进而促进将实验室的肝癌研究成果转化到临床应用上的目标$现将有关小鼠肝癌模型研究进行概述$ H致癌物诱发的小鼠肝癌模型 致癌物诱发的肝癌小鼠模型经常被用于肝癌的研究中$人类致肝癌物可分为两类:遗传毒性和非遗传毒性的致癌物$遗传毒性致癌物是指能够与NJP反应，引发NJP损伤而致癌的化学致癌物;非遗传毒性致癌物则不直接与NJP反应，通过诱导宿主体细胞内某些关键性病损(如控制细胞增殖#细 ［$］ 胞凋亡和细胞分化)而导致肿瘤的化学致癌物$遗传毒性致癌物二乙基亚硝胺(N*J)是最常用的肝癌诱发化合物$研究表明，对!%n!(<的Z$K#O!雄性小鼠腹腔注射((+979体重)N*J，平 !’’i的Z$K#O!雄性小鼠患有肝癌［)］$均&&周后， 也有利用高剂量N*J(F’n\"’+979体重)腹此外， 腔注射&n(周龄小鼠，但该方法无前述方法有效$N*J诱导的小鼠肝癌模型不仅可用于研究肝癌发生的分子机制，还可用于评估和评价治疗肝癌的化学药物$然而，化学物诱导的小鼠肝癌模型虽然可以建立具体的遗传物质改变与致癌物之间的关［F］ 但是小鼠的性别#系，年龄#品系和遗传背景对肝癌发生的影响一直是用该方法构建模型的瓶颈$ 于抗肝癌药物的临床前评估$肿瘤形成速度快#劳动力要求小#成本相对较低#可无创性检测到肿瘤大小是异位移植的主要优势$而原位移植主要是通过浆膜下注射和外科原位移植(:?@9.2-/3@543536.2-/.,6/-A5-5.3A)肿瘤块$外科原位移植肿瘤块通常大 # 来源于人肝癌患者手术切除标本或小约为!,,， 者来源于皮下生长的肝癌细胞块$有许多研究报道微环境在恶性肿瘤细胞的生物学行为中有着非常重 ［!#］ 要的影响$例如:通过皮下移植的许多肿瘤细胞系并不能自发的发生肿瘤转移，而通过原位移植时它们可发生肿瘤转移，提示肿瘤细胞与器官特异性因子(成纤维细胞#内皮细胞和炎症细胞)的相互作用对肝癌的发生非常重要$由于该原因，基于异位模型的治疗结果必须要经过原位移植模型进行下一步验证$因此，这些原位移植的模型在肿瘤形态#微环境#转移性和对抗癌药物的反应等方面很好地模拟了人肝癌发生的情况$但肝癌原位移植模型的缺点是外科移植手术程序较为复杂并且价格昂贵，此外，对于肿瘤生长和药物反应的检测没有异位移植模型容易$尽管通过异位和原位移植方法构建的肝癌模型可以用于临床前检测和评价抗癌药物，但是这些模型在病人实际抗肿瘤效果上的预测价值较差$这些严重限制了肝癌的移植小鼠模型的用途和价值$ Q\\%=和\\\"=感染的小鼠肝癌模型 人类的肝癌F’i以上是由于乙肝病毒和(或) ［!&］ 丙肝病毒感染所致$因此，在过去的十几年中，多种乙肝和丙肝病毒性感染的动物模型被建立并研究$由于人的_Zb和_Kb不能诱发鼠的肝细胞发生肝炎，建立这些_Zb和_Kb的动物模型时通常 ［!(］ 需要嵌入人肝细胞$K4.:-@.等在!\"F(年通过转基因的方法把_Zb的NJP序列整合到小鼠的宿主基因组NJP中，从而构建_Zb感染慢性携带者的转基因小鼠模型$随后，携带由_Zb启动子或肝脏特异性启动子启动的_Zb基因组和单个_Zb基因(如:表达表面膜蛋白，e蛋白(_ZC)，核心蛋白和前 ［!$］ 核心蛋白)的多转基因小鼠模型被大量建立$利 表达_Kb多蛋白，单独的核心蛋白用同样的方法， 或结合包膜蛋白的转基因小鼠模型随后也被建［!)］ 立$这些模型可以用来研究体内肝脏损伤和细胞的恶性转化，并为病毒基因可以起始和促进肝肿瘤的发生提供了确凿的证据$进一步研究发现，乙 _Kb的核心蛋白是肝肝病毒外膜大蛋白和e蛋白， 癌发生的核心因子$然而由于已报道的_Zb和 F肝癌移植性的小鼠肝癌模型 由于肝癌移植小鼠模型适用对抗癌药物临床前 因此构建肝癌移植小鼠模型得到了长评价的研究， 足的发展$早期的移植模型主要是通过同基因品系小鼠肿瘤的移植$随后，通过移植人的肝癌细胞或 ［\"］ 组织块到免疫缺陷小鼠中构建肝癌模型$例如: Z细胞无胸腺和毛发的裸鼠(缺乏Q淋巴细胞和Q# ［!’］ ;重度联合免疫缺陷小鼠(:D‘D@D23,+功能削弱) B.AD<.,,?A3 随后_D6d%#癌细胞系用于移植瘤模型构建， _D6#Z#IXXK+))%!和_?_)等细胞系也被广泛地应用于肝癌移植瘤模型中$上述这些肝癌的移植小鼠模型可以通过异位和原位移植$异位移植的实现主要是通过移植肿瘤细胞和组织到小鼠皮下;人肝癌细胞通过异位移植到小鼠皮下已经广泛大量地用 中国实验动物学报%’!$年&月第%&卷第%期P25-W-BPA.,I2.I.A，P6@./%’!$，b3/1%&J31% %!( _Kb小鼠模型可以引发自身对_Zb和_Kb的免 疫耐受，因此这些模型对肝癌发生的影响的研究是在缺乏免疫应答的情况下进行$此外，这些_Zb和_Kb小鼠模型的肝癌发生相对不可预测性，且受小鼠品系影响较大，这些方面大大阻碍了用_Zb和_Kb感染小鼠作为研究肝癌的模型$ I基因修饰性的小鼠肝癌模型 随着小鼠基因打靶技术和基因编辑工具的发展(如:MOJ(8.A2V.A9D@A?2/D-:D:)［!F］#QPW*J:(5@-A+:2@.65.3A-25.‘-53@+/.^DDVVD253@A?2/D-:D:)［!\"］和KRHISR7K-:\"(2/?:5D@D<@D9?/-@/;.A5D@:6-2D<:43@56-/.A<@3,.2@D6D-5:7KRHISR-::32.-5D 小鼠模型已经有了相应报道$N?B3.:等构建了 HHH)启动的人的抗凝血酶启动子HHH(-A5.54@3,B.A+ Ib&’Q+P9(:.,.-A‘.@?:&’Q+-A5.9DA)的小鼠模型，这些小鼠模型在F月龄时!’’i检测到有肝癌的发 ［%%］ 生，其中!’i有肝癌转移的发生$X?@-^-,.等 ,;2和QdO+’的双构建出在肝脏中同时过表达2+ 2+,;27XQ+QdO+转基因小鼠模型(P/B+’)!I-A53A.+ R?9.?等［%#］证实了该双转基因小鼠模型在F月龄!’’i的雄性和#’i的雌性个体中检测到有肝中， 癌的发生，并且该双转基因小鼠模型比仅过表达2+,;2或QdO+’的小鼠要更早#更快地发生肝癌$O-A等［%&］报道了酰基辅酶P氧化酶(P3C)敲除小鼠模型，该模型表现出重度脂肪肝，最终导致分散的细 X<@%敲胞死亡，脂肪性肝炎，脂肪瘤和癌症$此外， ［%(］ 除小鼠模型也有报道$该模型缺乏可跨膜转运 糖蛋白，最卵磷脂到胆小管膜上的肝脏特异性的S+［%$］ 终导致炎症引发的肝癌的发生$W3?等构建了 P9小鼠模型，肝脏特异性条件表达的Ib&’Q+在该 小鼠模型中，两翼带有/3CS位点的终止信号位于Ib&’Q+P9基因的前面，P9基因可因此该Ib&’Q+ 以被能够特异性地在肝脏中表达K@D重组酶的腺病 P9在肝毒载体启动表达$K@D重组酶诱导Ib&’Q+ 脏中表达(个月后，该模型能够观察到明显的肝肿瘤$随后，有些研究团队采用条件性启动原癌基因突变策略构建了相应的小鼠肝癌模型$K3/A35［%)］ 在PSK(- $)i的小鼠在缺失的小鼠肝癌模型$在该模型中， K@D重组酶处理后的Fn\"个月可以观察到明显的 ,.RJP:的异常表达在肝癌中也被肝肿瘤$此外， ［%F］ 证实，由于,.RJP可能是潜在的肝癌治疗方［%\"］法，与,.RJP相关的基因修饰肝癌模型也被相 !%%(cY)和肝脏特异性敲应地建立$全敲除X.R+ !%%小鼠模型分别在(周和Fn!’周除(WcY)X.R+ F\"i的雄性和%#i的雌性小鼠开始出现炎症， (cY)在!’月龄出现肝癌肿瘤，而(’i雄性和!’i ［#’］ 雌性小鼠(WcY)在!%月龄出现肝肿瘤$M4-A9［#!］ 等利用QPW*J:技术成功在_%G#(细胞系中敲 2-5DA.A(K5AAB!)除肝癌细胞中常见发生突变的,+ 2-5DA.A(K5+和PSK，进而通过高压水动力法运送,+ AAB!)，成功在活并结合腺病毒包裹PSKQPW*J:， ［#%］ 体小鼠内敲除该两基因，构建肝癌模型$e?D等利用高压水动力法运送KRHISR7K-:\"系统在活体小鼠肝脏中同时敲除抑癌基因S5DA和6(#成功构建小鼠肝癌模型，该研究表明利用KRHISR7K-:\"系统可以在活体小鼠肝脏中敲除抑癌和原癌基因$此 jA5信号通路中的转录因子K5AAB/基因，外，它表达2-5DA.A，,+在肝癌中经常发生突变，该研究团队结合高压水动力法运送K5AAB!:9RJP:，K-:\"，长度为%’’个核苷酸的::NJP到ObZ小鼠肝脏，成功使得K5AAB/基因在&个位点上从丝氨酸7苏氨酸突变到丙氨酸$这些研究表明，基因修饰技术(特别是QPW*J:和KRHISR7K-:\")为建立肝癌模型提供了快速#简单和可靠的方法，为相关基因功能研究提供了新思路$ U结论和展望 理想的肝癌模型应能准确反映癌症生物特性和行为，充分模拟人类肿瘤微环境，且容易操作和获取$虽然目前尚无最理想的小鼠肝癌模型存在，但现有的动物模型在研究人类癌症的发生和发展上仍是非常宝贵的资源和工具$通常，异位移植物和原位移植小鼠肝癌模型可用于检测新的治疗方法，且原位移植小鼠模型非常适用于研究肝癌的转移;而基因修饰肝癌动物模型拥有较高的癌症转移率，在研究肝癌发生的分子机制方面是非常好的模型$随着基因编辑技术的迅速发展，高质量的小鼠肝癌模型将会有利于提高和改善对肝癌的研究和综合治疗方法的研发$现已有通过高压水动力法运送KRHISR7K-:\"质粒到成年小鼠肝脏敲除原癌基因和抑癌基因;后面可结合腺病毒或慢病毒包裹KRHISR7K-:\"系统在活体小鼠中敲除肝癌相关的原癌和抑癌基因，以期提高活体组织中的编辑效率$在利用KRHISR7K-:\"系统构建小鼠肝癌模型中，也 %!$ 中国实验动物学报%’!$年&月第%&卷第%期P25-W-BPA.,I2.I.A，P6@./%’!$，b3/1%&GJ31% O3^H和K-:\"N!’P系统来编辑小鼠肝可采用K-:\"+ 癌相关的原癌和抑癌基因，以降低脱靶效应$此外，在构建小鼠肝癌模型研究中小鼠和人之间的差异性在研究过程中也应该被考虑，如小鼠的代谢特征和免疫系统与人有着较大差异，下一步可以探索研究人源化小鼠模型用于肝癌模型的构建$总之，继续研发更适合的小鼠肝癌模型，对于探讨肝癌发生的分子机制#癌症信号通路#新型生物标记物#靶向药物的开发等方面可提供必要工具，以期最终加速将实验室的肝癌研究成果转化到临床应用$ 参 考 文 献 ［!］_DW，Q.-ANP，W.S]，_Dee1X3?:D,3 ［%］Z-^.@.W，j-9AD@*O1X3?:D,3 ［#］K4DA\\d，M4-A9Ij1W.‘D@2-A2D@D6. ［(］X3?_，cDAAD<;M，PA 2@3RJP6@3V./D:@D‘D-/:<.:2@.,.A-5.‘D@D:63A:D:V3//3=.A99DA3+53C.23@A3A+9DA353C.22-@2.A39DADC63:?@D.A6@.,-@;,3?:D4D6+-532;5D:［\\］1X?5-9DAD:.:1%’!(，#’:))!E)F&1 ［)］bD::D/.A3‘.524IN，c3^-X，X.4-./3‘.24J，D5-/1K-@2.A39DA.2+ .5;3V<.D54;/A.5@3:-,.AD.AAD=B3@A，.AV-A5，-A<-［F］_.@:5dW，Z-/,-.AP1O3@5;;D-@:3V2-A2D@,3 ［\"］Q@3.-A.Q，I24D55.A3K，X-@5.AD//.*，D5-/1Q4D?:D3VCDA39@-V5 ,3 ［!!］Z-A^D@5RZ，*9./,D8Jc，_D::IN1_?,-A+IKHN,3?:D24.,D+ @.2,3 /-@2-@2.A3,-,3 .2/D?^D,.-2D//:.A54D5?,3@,.2@3DA‘.@3,DA5:P@D‘.D=3V54D.A‘.5@3-A<2/.A.2-/5@.-/:53<-5D［\\］1j3@/<\\K/.AK-:D:1%’!(，#:$\"&E)’&1 ［!&］W.W，j-A9_1_D5D@39DAD.5;3V/.‘D@2-A2D@-A<6D@:3A-/.8D< 54D@-6;［\\］1K-A2D@WD551%’!(，):I’#’&E#F#(1 ［!(］K4.:-@.Ob，S.A^D@5KP，X./.24NR，D5-/1P5@-A:9DA.2,3?:D ,3 ［!$］W.]，Q-A9M]，_3?\\e1_D6-532D//?/-@2-@2.A3,-:.A:.945V@3,-A+ .,-/,3 9DAD:.:.A4D6-5.5.:K‘.@?:-::32.-5D［!F］K-@BD@;HN，\\.N，_-@@.A953AP，D5-/1Q-@9D5D<9DA3,D,3<.V.+ 2-5.3A.A,.2D?:.A98.A2+V.A9D@A?2/D-:D:［\\］1dDAD5.2:1%’!’，!F$:&(!E&(\"1 ［!\"］jDVD@:Z，S-A<-Ic，Y@5.8Y，D5-/1dDAD@-5.3A3V5-@9D5D< ,3?:D,?5-A5:B;D,B@;3,.2@3.A>D25.3A3VQPW*J,RJP［\\］1J-5S@35321%’!#，F:%#((E%#)\"1 ［%’］]3?A9IPX，P.5^DAR\\，H^-=-X1P<‘-A5-9D:3V?:.A954D 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